Функционализированная изоляция клеток-мишеней на основе проводов: метод ex vivo для выделения раковых клеток из периферической крови с шипами

Молекулы адгезии эпителиальных клеток, или EpCAM, представляют собой поверхностные трансмембранные гликопротеины, сверхэкспрессируемые в быстро пролиферирующих эпителиальных клетках при раке предстательной железы. Чтобы выделить клетки, экспрессирующие EpCAM, начните с медицинской проволоки с функционализированным наконечником с золотым покрытием. Функционализация слоев полимерного геля, содержащего ковалентно связанные EpCAM-специфические антитела.

Погрузите проволоку в суспензию периферической крови, содержащую флуоресцентно меченые раковые клетки. Следите за тем, чтобы функционализированная часть оставалась смоченной в кровяной суспензии. EpCAMs на раковых клетках распознают и связываются со своими специфическими антителами, функционализированными на проводе.

Промойте с буфером, чтобы удалить все несвязанные элементы с поверхности провода. Согните провод и закрепите его на стеклянном предметном стекле, содержащем буфер, при этом функционализированная часть будет погружена в буфер. Используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы проверить яркую флуоресценцию цитоплазмы и ядер клетки и подтвердить наличие захваченных клеток на проволоке.

Обработайте проволоку с помощью антиадгезионного буфера. Протеолитические ферменты в буфере расщепляют полимерный гель, высвобождая в буфер комплексы антитела-раковые клетки. Центрифугируйте проволочную сборку для сбора высвобождающихся комплексов антитело-клетка в грануле. Удалите проволоку и надосадочную жидкость, содержащую фермент. Повторно суспендируйте целевую клеточную гранулу в подходящей среде.

В 5 миллилитров периферической крови добавьте от 500 до 500 000 клеток, а затем перемешайте, перевернув трубку. После извлечения провода из отсека для хранения снимите резиновый колпачок, который удерживает провод, промойте провод в 1x фосфатно-солевом буфере и установите его в колпачок трубки. Затем инкубируйте трубку на наклонном роликовом миксере со скоростью 5 оборотов в минуту в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации трижды промойте проволоку в 1x фосфатно-солевом буфере. Затем храните проволоку в 15-миллилитровой тубе, содержащей 1x фосфатно-солевой буфер, в темноте.

Нарисуйте прямоугольную область на предметном стекле с помощью смазочной ручки и добавьте на нее 500 микролитров 1x фосфатно-солевого буфера. Чтобы погрузить функциональную часть проволоки в 1x фосфатно-солевой буфер, согните нефункциональную часть проволоки и поместите ее на предметное стекло. Чтобы подсчитать количество захваченных ячеек, визуально осмотрите обе стороны провода. После осмотра перенесите проволоку обратно в 15-миллилитровую трубку с 1x фосфатно-солевым буфером и храните в темноте.

В 1 миллилитре 1x фосфатно-солевого буфера растворите 4 миллиграмм разделительного буферного компонента. Затем отфильтруйте раствор через стерильный фильтр размером 0,2 микрометра, чтобы получить готовый к использованию буфер. Далее прогрейте высвобождающий буфер до 37 градусов Цельсия в течение 5 минут. После нагревания перенесите 1,6 миллилитров разделительного буфера, чтобы полностью заполнить реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Далее инкубируйте функциональную часть проволоки в высвобождающем буфере при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане в течение 20 минут.

После инкубации поместите проволоку на шейкер со скоростью 500 оборотов в минуту на 15 минут. Затем центрифугируйте проволоку при 300 х г в течение 10 минут. После окончания центрифугирования вытесните проволоку из пробирки, закройте крышку и снова центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 10 минут.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.