Высокая пропускная способность автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для белка терапии

Общая цель данной процедуры заключается в создании производственных клеточных линий для биопрепаратов, обладающих клональностью и высокой продуктивностью. Это достигается путем первоначальной трансфекции клетки-хозяина ДНК, кодирующей интересующий ген. Следующим этапом процедуры является выделение высокопродуктивных клонов с помощью FACS с последующей документацией образования колоний с помощью системы CloneSelect Imager.

Заключительным этапом является скрининг и отбор высокопродуктивных клонов. В конечном итоге с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ можно получить результаты, демонстрирующие выработку антител в культурах с непрерывным питанием и в периодических культурах с подпиткой. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы сортировки и pcan 80 dgl трудно освоить из-за сложности настройки оборудования при выполнении этих процедур; следующие ученые из лаборатории продемонстрируют эти процедуры: Джейсон Сандерс покажет процесс трансфекции клеток-хозяев и сортировку для документирования образования колоний, а Рассел Кан — отбор проб с помощью системы Tecan.

Для начала данной процедуры за один день до трансфекции высейте клетки-хозяева в культуральный флакон в 15 milliliters ростовой среды. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 7.5% carbon dioxide. На следующий день приготовьте трансфекционные комплексы: сначала разведите 8 µg DNA в 800 µL ростовой среды без сыворотки в стерильной микроцентрифужной пробирке и осторожно перемешайте. Затем разведите 40 µL липосом в 800 µL ростовой среды без сыворотки в полистирольной пробирке.

Добавьте разведенную ДНК к разведенному Lipofectamine. Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы подготовить клетки-хозяева к трансфекции. Удалите из культура в среду для роста и замените ее 6.4 milliliters среды для роста без сыворотки.

Добавьте 1,6 мл трансфекционных комплексов в колбу. Осторожно перемешайте, покачивая колбу. Инкубируйте клетки при 37 °C в CO₂-инкубаторе в течение шести часов.

Через шесть часов добавьте в колбу восемь миллилитров ростовой среды и инкубируйте при 37 °C в CO₂-инкубаторе в течение ночи. Удалите среду путем аспирации и добавьте в колбу свежую ростовую среду. Повторно инкубируйте клетки в течение ночи.

Замените ростовую среду на селективную среду. Инкубируйте клетки при 37 °C в CO₂-инкубаторе в течение двух-трех недель. Через две-три недели после трансфекции клетки будут готовы к клонированию методом сортировки клеток с помощью проточной цитометрии (FACS). Снимите клетки с поверхности флакона и центрифугируйте при 800 RPM в течение пяти минут при 4 °C.

Ресуспендируйте клетки в селекционной среде с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина. Затем добавьте флуоресцентно меченые антитела к IgG человека. Добавьте разведение в пропорции от 1 к 20, инкубируйте на льду от 15 до 30 минут, после чего дважды промойте холодным PBS и ресуспендируйте клетки в одном объеме XPBS в полипропиленовой пробирке.

На данном изображении представлен пример окрашенных клеток. Для проведения асептической сортировки на системе BD FACS Aria подготовьте 96-луночный планшет для культивирования клеток, содержащий по 200 µL селекционной среды в каждой лунке. В асептических условиях загрузите пробирку с клетками в BD FACS Aria и зарегистрируйте результаты для окрашенных и неокрашенных клеток соответственно.

Установите гейты и параметры для сортировки одиночных клеток с требуемым профилем флуоресцентного окрашивания в 96-луночный планшет. Инкубируйте планшет в инкубаторе при 37 °C в течение двух недель. В день 0, на 3-й, 7-й и 13-й дни после сортировки зафиксируйте образование колоний в 96-луночном планшете с помощью системы имиджинга для селекции клонов, чтобы убедиться, что выбранные клоны произошли от одной клетки, и отобрать высокопродуктивные клоны. Сначала зафиксируйте положение образцов в приемном 96-луночном аналитическом планшете. Затем с помощью роботизированной системы дозирования жидкостей перенесите аликвоты супернатанта объемом 20 µL в каждую лунку 96-луночного аналитического планшета. Продукция антител в образцах анализируется с помощью сэндвич-метода.

Определение человеческого IgG методом ELI SA на системе автоматизированного дозирования жидкостей осуществляется следующим образом. Сначала образцы и стандарт наносятся на предварительно кодированные планшеты для анализа с биопокрытием из антител к IgG человека. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение двух часов, после чего проводят три промывки раствором PBS.

Затем на планшеты в разведении 1:2000 добавляют очищенные антитела козы к IgG человека, конъюгированные с HRP, и инкубируют планшеты в течение одного часа при комнатной температуре. По истечении одного часа планшеты трижды промывают PBS, после чего добавляют субстрат ABTS.

Наконец, планшеты считывают на планшетном ридере, используя абсорбцию при 405 нанометрах для детекции. С помощью этой автоматизированной платформы было обнаружено, что уровень поверхностных антител, определенный путем окрашивания флуоресцентно мечеными антителами к IgG человека, коррелирует с продуктивностью антител клетки. Как показано здесь для двух лучших клонов, полученных из популяции клеток с высокой экспрессией поверхностных антител, удельная продуктивность варьировала от 50 до 70 пикограмм на клетку в день.

Напротив, продуктивность антител составляла примерно 20 пг на клетку в день для двух лучших клонов, полученных из популяции клеток с низким уровнем экспрессии поверхностных антител. Более того, клеточные линии, разработанные с помощью FACS-сортировки, более стабильны в отношении продукции антител, чем линии, клонированные методом ручного лимитирующего разведения. Удельная продуктивность лучшего клона (клон один), полученного путем ручного лимитирующего разведения, снизилась с примерно 30 PCD до примерно 10 PCD после культивирования в течение 80 удвоений клеток.

С другой стороны, лучший субклон, полученный путем FACS-сортировки клона два, был способен поддерживать удельную продуктивность на уровне около 20 PCD на протяжении не менее 100 удвоений клеток. Идентификация сайта интеграции трансгена в хромосоме клетки с помощью флуоресцентной гибридизации in situ показала, что клон один представляет собой смешанную популяцию фенотипов A и B. Напротив, отсортированный методом FACS клон оказался более однородной популяцией, в которой 99,5% клеток имели фенотип A. После просмотра этого видео у вас должно сформироваться четкое понимание того, как разрабатывать производственные клеточные линии для получения терапевтических белков.