Высокая пропускная способность автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для белка терапии

Общая цель этой процедуры заключается в разработке производственных клеточных линий для биологических препаратов с клональностью и высокой продуктивностью. Это достигается путем предварительного пересечения клетки-хозяина с ДНК, кодирующей интересующий ген. Следующим этапом процедуры является выделение высокопродуктивных клонов по фактам с последующим документированием образования колоний с помощью формирователя изображений для отбора клонов.

Заключительным этапом является отсеивание и отбор высокопродуктивных клонов. В конечном итоге могут быть получены результаты, показывающие выработку антител в непрерывных и периодических культурах с помощью ВЭЖХ с обратной фазой. Видео. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как сортировка фактов и шаги pcan 80 dgl трудно изучить, потому что эти процедуры включают в себя сложную установку, следующие ученые из лаборатории продемонстрируют эти процедуры для трансфекции эффекта клетки-хозяина, сортируя Джейсона Сандерса для документирования образования колоний и Рассела Кана для отбора образцов текана.

И Элиза: Чтобы начать эту процедуру, за сутки до трансфекции засейте клетки хозяина в колбу для клеточной культуры в 15 миллилитров роста. Терпимая. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 7,5% углекислым газом на следующий день, приготовьте трансфекционные комплексы, сначала разведите восемь мкг, ДНК в 800 микролитрах питательной среды без сыворотки в стерильной микроцентрифужной пробирке, аккуратно перемешайте. Далее разведите губу 40 микролитров в 800 микролитрах питательной среды без сыворотки в полистирольной тубе.

Добавьте разбавленную ДНК к разведенному липофектамину. Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы подготовить клетки-хозяева к трансфекции. Удалите питательную среду из клеток и замените 6,4 миллилитрами питательной среды без сыворотки.

Добавьте в колбу 1,6 миллилитра трансфекционных комплексов. Аккуратно перемешайте, покачивая колбу. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом в течение шести часов.

Через шесть часов добавьте в колбу восемь миллилитров питательной среды и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом на ночь на следующий день. Удалите среду путем аспирации и добавьте в колбу свежую среду для роста. После ночной инкубации клетки снова инкубируйте на ночь.

Замените питательную среду на селекционную. Терпимая. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом в течение двух-трех недель. Через две-три недели после трансфикации клетки готовы к клонированию с помощью проточной цитометрии, активированной сортировкой клеток, вытесненных клеток из колбы и центрифугированием при 800 оборотах в минуту в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Ресуспендируют клетки в селекционной среде, дополненной 2% бычьим сывороточным альбумином. Затем добавьте флуоресцентно меченые антитела IgG к человеку. Добавить в разведении от одного до 20 инкубировать на льду от 15 до 30 минут, а затем дважды промыть холодной PBS ресуспендировать клетки в одну XPBS в полипропиленовую пробирку.

Пример окрашенных клеток показан на этом рисунке для асептической сортировки на факсе BD для подготовки 96-луночного планшета для культивирования клеток, который содержит 200 микролитров отборочной среды в каждой лунке. Асептически загрузите трубку с ячейками и проанализируйте факты BD. Ария, запишите результаты для окрашенных и неокрашенных клеток соответственно.

Установите затворы и настройки для сортировки отдельных клеток с нужным профилем флуоресцентного окрашивания в планшете 96 Лунка Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух недель в нулевой день, третий день, седьмой день и день 13 постфактум Сортировка задокументируйте образование колонии в 96-луночной пластине на имидж-сканере для отбора клонов, чтобы обеспечить отбор клонов, полученных из одной клетки, для скрининга и отбора высокопродуктивных клонов Клонов. Первый документ о положении образца в приемной 96 луночной пробирной пластине. Затем с помощью роботизированной системы обработки жидкостей передаются аликвоты 20 микролитров надосадочной жидкости в каждую лунку из 96 лунок испытательной пластины, продукция антител в образцах анализируется с помощью бутерброда.

IgG человека обнаруживает ELI SA на системе работы с жидкостями следующим образом. Во-первых, образцы и стандарт загружаются на предварительно закодированные планшеты для анализа IgG против человека. Планшеты инкубируются при комнатной температуре в течение двух часов, после чего следует три промывки PBS.

Далее иммуночистый козий античеловеческий IgG. HRP добавляют в планшеты в разведении от одного до 2000 и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Через час пластины трижды промывают PBS, а затем добавляют подложку A BTS.

Наконец, пластины имеют красный цвет на считывателе пластин, использующем поглощение на 405 нанометрах для обнаружения. С помощью этой автоматизированной платформы было установлено, что поверхностный уровень антител, отраженный окрашиванием флуоресцентным меченым античеловеческим IgG, коррелирует с антителенной продуктивностью клетки. Как показано на рисунке, для двух основных клонов, полученных из клеточной популяции с высокой экспрессией поверхностных антител, удельная продуктивность составляла от 50 до 70 пикограмм на клетку в день.

Напротив, продуктивность антител составляла примерно 20 пикограмм на клетку в день для двух основных клонов, полученных из клеточной популяции с низкой экспрессией поверхностных антител. Кроме того, клеточные линии, полученные путем сортировки фактов, более стабильны в отношении продукции антител, чем те, которые были клонированы путем ручного ограничивающего разведения. Удельная продуктивность клона верхнего клона, полученного путем ручного ограничивающего разведения, снизилась с примерно 30 PCD до примерно 10 PCD после культивирования в течение 80 удвоений клеток.

С другой стороны, верхний субклон, сгенерированный вторым клоном сортировки факсов, смог поддерживать удельную производительность около 20 PCD по крайней мере для 100 удвоений ячеек. Идентификация сайта интеграции трансгена в клеточной хромосоме методом флуоресцентной гибридизации in situ показала, что первый клон является смешанной популяцией фенотипа А и фенотипа B.In контраста, факт сортировки клонов оказался более однородной популяцией с 99,5% клеток фенотипа А. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разрабатывать производственные клеточные линии для защиты терапевтических белков.