Multimer-PAGE для разделения нативных белковых комплексов: гибридная методика разделения, состоящая из Blue Native-PAGE и SDS-PAGE для выделения интактных мультимерных белков из лизата тканей

Мультимерные белковые комплексы необходимы для различных биологических процессов.

Чтобы разделить белковые комплексы в их нативном состоянии с помощью multimer-PAGE, берут лизат тканей, содержащий нужные комплексы. Загрузите лизат в гелевую сборку для нативной модели Blue PAGE.

Заполните систему щелочным рабочим буфером, содержащим синий анионный краситель, и подключите его к источнику питания. При щелочном pH молекулы красителя связываются с белковым комплексом, придавая ему общий отрицательный заряд без денатурации. Этот отрицательно заряженный, неповрежденный белковый комплекс мигрирует через гель в виде синей полосы.

После минимального прогона и позволяя неповрежденному белку мигрировать в разрешающий гель, удалите полоску, содержащую комплекс. Инкубируйте полоску в растворе, содержащем сшивающий агент, чтобы позволить его реакционноспособным группам взаимодействовать с аминогруппами проксимального белка, стабилизируя мультимерный комплекс.

Замените сшивающий раствор реагентом для гашения, чтобы снизить активность непрореагировавших сшивателей. Добавьте SDS - анионное моющее средство, которое придает равномерный отрицательный заряд неповрежденному белковому комплексу, сохраняя при этом их естественный размер и состав.

Поместите обработанную полоску в свежую кассету и повторно залите ее в новый гель SDS-PAGE. Во время электрофореза отрицательно заряженный сшитый белковый комплекс мигрирует к положительному аноду и проявляется в геле в виде полосы с высокой молекулярной массой.

Чтобы начать эту процедуру, подготовьте для синего нативного электрофореза полиакриламидом гель, как описано в текстовом протоколе. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте белки в геле при напряжении 150 вольт, пока полоса красителя не продвинется примерно на 2 сантиметра в разрешающий слой. В этот момент остановитесь и отключите электропитание.

После разборки аппарата электрофореза отделите стекла гелевой кассеты. Снимите и выбросьте слой укладки.

Аккуратно разрежьте гель, чуть ниже нижнего края лицевой стороны красителя, стараясь сделать этот срез как можно более ровным и прямым. Затем выбросьте неиспользованный кусочек геля. Обрежьте все неиспользованные участки по краям гелевой полоски.

Осторожно поместите полоску в 10 миллилитров фосфатного буферного раствора в небольшую емкость и аккуратно перемешайте путем нутации в течение 30 минут, чтобы сбалансировать. После уравновешивания выбросьте и замените PBS еще на 10 миллилитров.

Пипеткой 500 микролитров 25 миллимолярного DSP растворить в диметилсульфоксиде в PBS и продолжить перемешивание, как и раньше, в течение 30 минут. Через 30 минут слейте раствор DSP. Добавьте 10 миллилитров 0,375 моляра Tris-HCl, pH 8,8, содержащего 2% додецилсульфата натрия, чтобы погасить непрореагировавший DSP. Продолжайте накручивание в течение 15 минут.

Пока происходит закалка гелевой полоски, приготовьте растворы геля SDS-PAGE по стандартным методам. Не добавляйте реагенты для полимеризации. После закалки верните синюю родную гелевую полоску до комнатной температуры и залите полоску в новую гелевую кассету.

Для этого аккуратно поднимите гель и поместите его на чистую гелевую кассетную распорную пластину. Сориентируйте полосу так, чтобы она была перевернута от своей предыдущей ориентации, а нижняя часть лицевой стороны красителя была ближе всего к верхней части новой кассеты.

Расположите полосу так, чтобы ее верхний край лежал на одном уровне с тем местом, где будет верхний край накладки. Убедитесь, что лицевая сторона красителя параллельна горизонтальным краям стеклянной пластины. Прижмите одну сторону вырезанной полосы к одной из стенок распорки, оставив место с другой стороны для заливки геля и загрузки стандарта белка или лестницы. Если нижний край гелевой полоски содержит какие-либо неровные или неровные участки, аккуратно срежьте их.

После того, как гелевая полоска будет правильно размещена, наложите накладку на распорную пластину. Слегка надавите, чтобы вытолкнуть все захваченные пузырьки воздуха. Продолжайте собирать аппарат для заливки геля, в соответствии с инструкциями производителя.

Гелевая полоска иногда смещается при установке верхней пластины. Это помогает позволить полосе немного свисать над краем верхней пластины, чтобы ее можно было регулировать с помощью шпателя для коррекции любых смещений.

Добавьте в растворяющий гелевый буфер реагенты полимеризации, и залейте его в подготовленную гелевую кассету с помощью серологической пипетки. Заполните гелевую кассету примерно на 2 сантиметра ниже иссеченной синей нативной гелевой полоски PAGE, чтобы оставить место для слоя укладки. Затем добавьте 100 микролитров бутанола поверх залитого геля и дайте 30 минут для полимеризации растворяющего слоя, прежде чем выливать бутанол.

Далее добавьте реагенты полимеризации в раствор укладывающего геля. С помощью серологической пипетки налейте слой укладки, чтобы заполнить все оставшиеся пустые места в гелевой кассете. Наклоняйте гелевую кассету по мере заливки слоя укладки, чтобы она заполнила пространство под полоской геля и пузырьки воздуха не задерживались.

По мере того как буфер для укладки геля заполняет пустое пространство под полоской геля, постепенно возвращайте кассету с гелем на ровное положение. Продолжайте заполнять пустое пространство рядом с вырезанной гелевой полоской с помощью укладывающегося гелевого буфера, пока он почти не переполнится. Затем дайте слою для укладки полимеризоваться в течение 30 минут.

После того, как слой укладки полимеризуется, извлеките гелевую кассету из разливочного аппарата, промойте ее дистиллированной водой и соберите аппарат для электрофореза, согласно инструкциям производителя.

Полностью заполните внутреннюю камеру рабочим буфером 1X SDS-PAGE. Затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем. Загрузите место рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью лестницы с молекулярной массой или соответствующего стандарта белка.

Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте образцы при напряжении 120 вольт. Когда краситель Кумасси стекает с геля, остановите прогон и отключите электропитание. Анализируйте гель с помощью стандартных методов электроблоттинга и обнаружения белка на основе антител.