Трехкамерный анализ импеданса на основе матрицы: метод анализа в реальном времени для оценки инвазивного потенциала раковых клеток путем измерения электрического импеданса

Ассоциированные с раком стромальные клетки секретируют химические факторы, которые могут вызвать метастатические опухолевые клетки, находящиеся на базальной мембране ткани. Следовательно, раковые клетки проникают в базальную мембрану и мигрируют во внеклеточное пространство ткани.

Чтобы измерить инвазивную способность раковых клеток in vitro, начните с многолуночного планшета с несколькими трехкамерными массивами. В каждом массиве нижняя камера имеет адгезную культуру стромальных клеток. Верхняя камера с микроэлектродами для измерения импеданса с плавленным импедансом — миниатюрными электродами, измеряющими электрическую активность клетки, — покрыта раковыми клетками, которые прилипают к микропористой мембране, покрытой внеклеточным матриксом, присутствующей над электродами.

Во время инкубации на импедансном анализаторе стромальные клетки выделяют в среду хемотаксические факторы, которые движутся к раковым клеткам. Эти факторы перемещаются через полупроницаемую мембрану, присутствующую на нижней стороне средней камеры.

Факторы, секретируемые стромальными клетками, сигнализируют адгезивным раковым клеткам трансформироваться в инвазивные фенотипы. В ответ инвазивные клетки мигрируют через микропористую мембрану, достигая межпальцевых электродов на противоположной стороне мембраны.

Со временем, по мере того как все больше раковых клеток прилипает к электродам, они вызывают клеточный импеданс – препятствие для протекания тока клетками. Измерение клеточного импеданса свидетельствует об инвазивном потенциале раковых клеток.

Поместите все три стерильные камеры в колпак для культуры тканей. Расположите ручку на короткой стороне нижней камеры и сориентируйте нижнюю камеру так, чтобы ручка была обращена к экспериментатору.

Добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 90 микролитров среды в каждую лунку из нижней камеры, не образуя пузырьков. Используйте 5% среды с добавлением бычьей сыворотки плода в двух нижних камерах в качестве положительного контроля подвижности клеток и используйте 0% среды с добавлением сыворотки в качестве отрицательного контроля.

Поверните нижнюю камеру на 90 градусов, дав ей отстояться в течение 10-15 минут в вытяжке. Затем поместите среднюю камеру сверху, чтобы ручка на нижней камере скользнула в выемку на средней камере. Толкайте камеру вертикально вниз, пока не раздастся щелчок с каждой из длинных сторон сборки.

Добавьте 160 микролитров среды, не содержащей сыворотки, во все лунки средней камеры. Убедитесь, что после заполнения лунок виден куполообразный мениск, и поместите верхнюю камеру электродами вниз на среднюю камеру, чтобы выровнять синие точки на средней и верхней камерах. Нажмите на камеру вертикально вниз до тех пор, пока с каждой из длинных сторон сборки не будет слышен щелчок.

Добавьте от 20 до 50 микролитров среды, не содержащей сыворотки, в верхнюю камеру. Установите сборку на клеточный анализатор двойного назначения в инкубатор для тканевых культур и подождите 30 минут, прежде чем измерять фон.

Откройте программное обеспечение для анализа клеток, затем выберите док-станцию, которую вы будете использовать, затем нажмите на вкладку «Сообщение» и убедитесь, что на ней написано «Подключения в порядке», чтобы убедиться, что матрица правильно размещена в базовой станции, а электроды хорошо выровнены с датчиками.

Перейдите на вкладку «Заметки об эксперименте» и заполните всю возможную информацию об эксперименте. Затем перейдите на вкладку «Макет» и заполните описание макета массива. Затем нажмите на вкладку «Расписание» и добавьте два шага из меню «Шаги»; фоновый шаг с одним разверткой и тестовый шаг со 100 развертками.

После того, как матрица пробудет в инкубаторе клеточного анализатора двойного назначения в течение 30 минут, нажмите кнопку «Воспроизведение», чтобы начать фоновое измерение.

После завершения фонового измерения извлеките матрицу из подставки и поместите ее обратно в колпак для клеточных культур. Затем добавьте от 30 000 до 50 000 клеток в 100 микролитров среды, не содержащей сыворотки, в каждую лунку верхней камеры. Это клетки, которые электрод обнаружит после того, как они успешно мигрируют через мембрану.

Дайте сборке постоять в колпаке в течение 30 минут перед установкой на анализатор ячеек двойного назначения для измерения импеданса.

Поместите массив обратно в анализатор ячеек двойного назначения и проверьте вкладку «Сообщение» на наличие сообщения «Подключения в порядке». Нажмите на кнопку «Воспроизведение», чтобы начать измерение импеданса, а затем перейдите на вкладку «График», чтобы отслеживать ход сигнала.

Если конечная точка достигнута раньше чем через 25 часов, нажмите на шаг «Отмена» в выпадающем меню «Выполнить». Чтобы экспортировать данные, щелкните правой кнопкой мыши по графику, выберите «Копировать» в формате списка, а затем вставьте данные в таблицу.