Метод анализа взаимодействия между белками приманки и добычи на основе ИФА

Физическое взаимодействие между двумя белками-партнерами модулирует нисходящие биологические механизмы.

Для выявления белок-белковых взаимодействий с помощью иммуноферментного анализа ИФА берут многолуночный иммуноферментный планшет. Добавьте оболочечный буфер, содержащий один из взаимодействующих белков — белок приманки — и инкубируйте. Белки приманки адсорбируются на поверхности скважины за счет неспецифических гидрофобных взаимодействий.

Выбросьте отработанный раствор и промойте пластину буфером, чтобы удалить несвязанные белки. Добавьте блокирующий раствор и инкубируйте, позволяя молекулам блокирующего агента раствора блокировать неспецифические участки связывания на поверхности лунки.

Добавьте партнера по взаимодействию белка — белок-добычу — помеченный остатками гистидина для удобства количественного определения. Инкубируйте, позволяя белку добычи специфически связываться со своим интерактивным партнером — приманкой. Добавьте раствор антигистидиновых антител, конъюгированных с ферментами пероксидазы хрена, которые связываются с добычей, образуя комплекс приманка-добыча-антитела.

Пипетку пипеткой введите раствор, содержащий субстрат фермента и перекись водорода, и инкубируйте.

Фермент пероксидаза хрена использует перекись водорода для каталитического окисления своего субстрата — образуя продукт синего цвета. Добавьте кислотный раствор, который денатурирует фермент, чтобы остановить реакцию, образуя желтый продукт реакции.

С помощью считывателя микропланшетов измерьте интенсивность цвета продукта, которая пропорциональна количеству связанного белка добычи и указывает на успешное белок-белковое взаимодействие.

Чтобы подготовиться к ИФА, нанесите по 100 микролитров белкового раствора в каждую лунку микротитровального планшета Polysorp. Закройте пластины крышкой и храните при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи, чтобы облегчить иммобилизацию белка на лунках микротитровых пластин. Слейте раствор с пластины для микротитрования, наклонив ее вверх дном над раковиной. Затем трижды промойте лунки 300 микролитрами PBS на лунку.

Лунки с покрытием закупорить на 1 час при комнатной температуре PBS, содержащим 2,5 весовых объемных процентов BSA. После удаления блокирующего раствора трижды промойте лунки 300 микролитрами PBST на лунку. Теперь добавьте 100 микролитров 50 наномолярных рекомбинантных PH с мечкой His, в каждый образец. В контрольные лунки добавляйте всего 100 микролитров PBS-BSA. Выдержите тарелку в течение 1 часа при комнатной температуре.

После инкубации выбросьте белковый раствор и удалите несвязанные белки, трижды промыв лунки 300 микролитрами PBST на лунку. Затем добавьте 100 микролитров PBS-BSA, содержащего поликлональные антитела против пероксидазы хрена.

После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре трижды промойте лунки 300 микролитрами PBST на лунку. Детектируйте комплексы антиген-антитело, добавив в каждую лунку по 100 микролитров реагента для детектирования ИФА. Затем добавьте 50 микролитров 1 молярной серной кислоты на лунку, чтобы остановить реакцию. Измерьте оптическую плотность лунок на расстоянии 450 нанометров с помощью считывателя микропланшетов.