Анализ антигенных отношений между вирусами с помощью микронейтрализационного анализа на основе изображений

Добавляйте среду и последовательно разбавленные антисыворотки, разрушающие рецепторы, обработанные ферментами, на монослои клеток млекопитающих, предотвращая связывание неспецифических вирусов.

Добавьте суспензию вируса гриппа. Антитела к антисывороткам, специфичные к вирусным белкам, связываются, нейтрализуя вирусы и предотвращая проникновение в клетки.

Низкая концентрация нейтрализующих антител или ненейтрализующих антител способствует неэффективному связыванию вирусного антигена, что позволяет вирусу прикрепляться к клеточным рецепторам.

Выбросьте носители. Нанесите целлюлозосодержащий материал, образуя полутвердое покрытие.

Вирус использует механизмы клетки-хозяина для образования вирусных частиц и вызывает лизис клеток.

Наложение ограничивает движение вируса, способствуя локализованному заражению и создавая отверстия в клеточных монослоях.

Снимите накладку. Фиксируйте и проникайте в клетки.

Постирайте с буфером. Добавьте антитела, связывающие вирусные антигены внутри проникнутых клеток.

Пипетка пероксидазы хрена конъюгированных вторичных антител, связывающихся с первичными антителами.

Введите пероксидазные субстраты и перекись водорода, в результате чего получится синий продукт.

Лунки изображений для количественной оценки инфицированных вирусом клеточных популяций на фоне антисывороточных разведений.

Определение разведений антисывороток, указывающих на указанное снижение популяции инфицированных клеток, для определения титров нейтрализации.

Чтобы провести обезвреживание вируса, подготовьте клеточный монослой за два-три дня, затем добавьте по 50 микролитров ВГМ в каждую лунку пластины. Используйте столбцы 11 и 12 для борьбы с вирусом и контроля клеток, соответственно. Добавьте 50 микролитров аликвот разведения фермента, разрушающего рецепторы, или сыворотки, обработанной RDE, в первый ряд столбцов с 1 по 10.

Выполните двойное серийное разведение, перенеся 50 микролитров из ряда A в ряд H и отбросив 50 микролитров из ряда H. Затем добавьте по 50 микролитров разбавителя в каждую лунку контрольной колонки ячейки. Добавьте по 50 микролитров вируса в каждую лунку планшета, кроме контрольной колонки клеток. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех часов. Затем удалите инокулянт и добавьте накладку в каждую лунку. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия без помех. Затем зафиксируйте и покрасьте пластины.

Чтобы количественно оценить нейтрализацию, поместите пластину лунки в область сканирования планшетного сканера. Отсканируйте планшет и запустите программное обеспечение для чтения лунок для расчета необходимых титров вирусов.