Метод иммунофлуоресценции для количественной оценки репликационного стресса в раковых клетках

Начнем с раковых клеток, несущих IdU, синтетический заменитель нуклеотида тимидина, уже интегрированный в их ДНК. Когда эти клетки сталкиваются с репликационным стрессом, их синтез ДНК останавливается, обнажая IdU в открытых одноцепочечных участках ДНК.

Зафиксируйте клетки и добавьте молекулы детергента, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой.

Добавьте БСА для блокировки нецелевых сайтов связывания антител.

Введение антител против IdU, которые взаимодействуют с одноцепочечной ДНК, меченной IdU.

Добавьте меченные зелеными флуорофорами вторичные антитела, которые нацелены на антитела против IdU. Удалите несвязанные антитела.

Поместите покровное стекло на предметное стекло, содержащее монтажный материал с флуоресцентным красителем, который окрашивает ядра.

Под флуоресцентным микроскопом понаблюдайте за ядрами синего цвета.

Зеленые флуоресцентные фокусы представляют собой антитела, связывающиеся с одноцепочечной ДНК.

Подсчитайте количество очагов, чтобы количественно оценить уровень репликационного напряжения.

Добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии на поли-L-лизиновые покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночного планшета, и выращивайте клетки в культуральной среде в стандартных условиях. После одного удвоения популяции аспирируйте существующую среду из планшета и пульсируйте клетки 10 микромолярными IdU для двух последующих удвоений популяции.

Чтобы собрать клетки, замените среду ледяной 0,5% PBSTx на льду на 5 минут. Для фиксации клеток необходимо аспирировать PBSTx и инкубировать клетки в течение 15 минут с 3% параформальдегидом при комнатной температуре. После 3-4 стирок PBS держите неподвижные элементы при температуре 4 градуса Цельсия до дальнейшего использования.

После фиксации пропитайте клетки с помощью 0,5% PBSTx на льду в течение 5 минут, обеспечивая покрытие всего покровного стекла. После промывания клеток от 3 до 4 раз 1 миллилитром 0,2% PBST при комнатной температуре, аспирируйте PBST и блокируйте образцы, используя 5% BSA, изготовленный в PBS, в течение 30 минут при комнатной температуре.

Для иммуноокрашивания подготовьте увлажненную камеру, положив влажное бумажное полотенце на посуду Tupperware с плоским дном. Накройте 24-луночную пластину крышкой парапленкой. Поместите его во увлажненную камеру, а на крышку тарелки положите покровные стекла. Добавьте 60 микролитров разведенного первичного антитела мыши против BrdU на верхнюю часть покровного стекла.

В качестве альтернативы, чтобы уменьшить высыхание антител и использовать меньший объем, поместите каплю разведенного антитела на парапленку и накиньте на нее покровное стекло. Затем инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации аспирируйте первичное антитело.

Верните покровные стекла обратно на 24-луночную пластину и промойте их 0,2% PBST 4 раза. Добавьте разведенное вторичное антитело на покровную крышку, как было показано ранее, и инкубируйте в течение одного часа в темноте при комнатной температуре. Наклейте метку на предметное стекло микроскопа и закрепите покровное стекло на предметных стеклах с помощью монтажного материала DAPI. Храните предметные стекла в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов, если монтажный материал нуждается в отверждении или закалке.