Метод иммунофлуоресценции для количественной оценки репликационного стресса в раковых клетках

Начнем с раковых клеток, несущих IdU, синтетический заменитель нуклеотида тимидина, уже интегрированный в их ДНК. Когда эти клетки сталкиваются с репликационным стрессом, их синтез ДНК останавливается, обнажая IdU в открытых одноцепочечных участках ДНК.

Зафиксируйте клетки и добавьте молекулы детергента, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой.

Добавьте БСА для блокировки нецелевых сайтов связывания антител.

Введение антител против IdU, которые взаимодействуют с одноцепочечной ДНК, меченной IdU.

Добавьте меченные зелеными флуорофорами вторичные антитела, которые нацелены на антитела против IdU. Удалите несвязанные антитела.

Поместите покровное стекло на предметное стекло, содержащее монтажный материал с флуоресцентным красителем, который окрашивает ядра.

Под флуоресцентным микроскопом понаблюдайте за ядрами синего цвета.

Зеленые флуоресцентные фокусы представляют собой антитела, связывающиеся с одноцепочечной ДНК.

Подсчитайте количество очагов, чтобы количественно оценить уровень репликационного напряжения.

Добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии на поли-L-лизиновые покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночного планшета, и выращивайте клетки в культуральной среде в станда