Workflow для высокого содержания, отдельная клетка количественной флуоресцентных маркеров из Всеобщей микроскоп данных, поддерживаемые ПО с открытым кодом
December 16th, 2014
Представлен гибкий информатика рабочий позволяя мультиплексированных на основе образа анализ флуоресцентно меченых клеток. Рабочий процесс количественно ядерных и цитоплазматических маркеров и вычисляет маркер перемещение между этими отсеками. Процедуры предназначены для возмущения клеток с использованием миРНК и надежную методику для обнаружения маркера путем непрямой иммунофлуоресценции в форматах 96-а.
Общая цель этой процедуры заключается в объективном измерении реакции отдельных клеток путем количественной оценки интенсивности специфических флуоресцентных маркеров на изображениях микроскопа. Это достигается путем предварительного подвергнутия адгезивных клеток культуры тканей нокдауну, опосредованному ирнками. На втором этапе клетки окрашивают флуоресцентно, а затем визуализируют на наличие нескольких интересующих их маркеров.
На заключительном этапе экспрессия маркеров в конкретных субклеточных областях определяется алгоритмически, представляя собой отдельные клетки. В конечном счете, клеточные реакции на биологические сигналы от нокдауна генов могут быть проанализированы путем измерения уровней флуоресцентной экспрессии интересующих маркеров и их субклеточной транслокации. Тем не менее, эта процедура дает представление о регуляции транзита G одного клеточного цикла в ответ на миРНК.
Он также может быть применен для исследований, генерирующих изображения флуоресцентных клеток, изучающих ядерный транспорт и белковый гомеостаз. Демонстрировать процедуру будут Даниэль Век и Кар К ХО, постдоки из моей лаборатории Бегин, диспенсировав 70 микролитров 200 наномолярных ирнк, разведенных в буфере ирнк в соответствующие лунки стерильного 96-луночного планшета в шкафу для стерильных культур тканей. Затем добавьте 105 микролитров трансфекционного липида, разведенного в 40 объемах сыворотки свободной среды DMEM, в каждую лунку перемешайте пластину путем слабой вибрации комнатной температуры, а затем через 10 минут разделите полученные 175 микролитров на три репликации по 50 микролитров на каждую мишень в непрозрачную тканевую культуру, обработанную 96 лункой планшета с прозрачным основанием.
Затем диспенсируйте 8 000 клеток на лунку в 150 микролитрах DMEM с 10%-ной сывороткой непосредственно на 50 микролитров комплексов липидных ирнк без смешивания. Затем запечатайте пластину стерильной клейкой дышащей мембраной и поместите пластину во увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 48 часов отсасывают среду из планшетов.
Затем зафиксируйте ячейки в 100 микролитрах 4%-ного буферного формальдегида в вытяжном шкафу при комнатной температуре Через 10 минут аспирируйте фиксатор и выполните три промывки по 100 микролитров PBS после последней промывки. Удалите PBS и перфорируйте клетки тремя циклами инкубации раствора по 100 микролитров по 10 минут каждый при комнатной температуре без встряхивания. После последней инкубации удалите проникающий раствор и затем добавьте 100 микролитров блочного раствора на лунку в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем аспирируйте блочный раствор и зондируйте клетки 50 микролитрами первичного представляющего интерес антитела в течение двух недель после мечения с помощью конфокального микроскопа uc с объективом 20 x для получения отдельных 16-битных изображений TIFF в оттенках серого в трех каналах, соответствующих ДНК-красителю GFP и иммуноокрашиванию. Flora fours захватывает множество неперекрывающихся наборов изображений или кадров для получения изображения примерно от 1000 до 2000 клеток на лунку. Систематическое именование файла изображения с использованием метаданных таким образом, чтобы каждое имя файла представляло собой уникальную комбинацию названия эксперимента, адреса скважины, номера кадра и идентификатора канала.
Затем откройте программу профилирования ячеек и нажмите «Файл и импорт конвейера». Затем в разделе «Из файла» выберите файл трехканального конвейера CP Pipe, который содержит необходимые инструкции для программного обеспечения по интерпретации метаданных файла изображения из сохраненного имени файла Convention Cell Profiler теперь можно использовать для сопоставления изображений, извлечения интенсивности ядерной ДНК и антител из файлов и использования канала GFP для расчета соотношения интенсивности ядерной и цитоплазмы. Для каждой обнаруженной ячейки нажмите кнопку просмотра параметров вывода, а затем выберите входные и выходные папки по умолчанию.
Выбор местоположения файлов изображений для анализа и места назначения извлеченных данных соответственно. Затем в окне модулей анализа щелкните соответствующие значки глаз, чтобы наблюдать за окнами идентификации первичных объектов и третичных объектов во время анализа, и нажмите кнопку Анализировать изображения, когда анализ будет завершен. Нажмите OK в окне сообщения и перейдите в папку вывода по умолчанию Location, где все файлы данных сохраняются в виде файлов значений, разделенных запятыми.
Чтобы выполнить извлечение данных, найдите новый файл CSV для ядер, включенный в выходные данные клеточного профилографа, который содержит данные об отдельных клетках для интенсивности флуоресцентных ядерных антител, интенсивности ядерной ДНК и значений соотношения двух репортеров GFP CDK. Скопируйте предоставленный файл сценария пульса в классификатор ходьбы PL в ту же папку, что и файл данных CSV ядер. Затем дважды щелкните значок Pearl Script.
И когда появится запрос, введите полное имя файла данных, за которым следует имя файла DOT CSV для файла, в котором клетки должны быть закрыты, и значения затвора для флуоресценции антител и двух репортерных данных G FP CDK. Убедитесь, что только что созданный файл сочетает в себе исходные значения анализа отдельных клеток из исходного профиля клеток данных с метками субпопуляций, показывающими, как каждая клетка из каждой лунки работает против обоих вентилей. Теперь откройте программное обеспечение R Studio, чтобы построить график данных для каждого экспериментального условия с использованием меток отдельных субпопуляций клеток, щелкнув «Файл» и «Открыть файл», а затем выбрав предоставленный файл анализа dot r.
Введите адрес компьютера папки, содержащей закрытые данные, включая букву диска и имя самого файла. Затем выделите линии от первой до 17 в верхнем левом окне нашей студии и нажмите на кнопку запуска, чтобы ввести пороговые значения экспериментальных данных и детали местоположения скважины. Наконец, выделите отдельные блоки оставшегося кода под строкой 17 и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы создать соответствующие графики.
Понаблюдайте за графиками в окне в правом нижнем углу нашей студии, а затем нажмите кнопку экспорта, чтобы сохранить их в различных форматах. Описанный здесь рабочий процесс анализирует изображения флуоресцентного микроскопа для получения исходных данных в виде списка с подробным описанием каждой идентифицированной клетки и соответствующими значениями анализа. Существует множество вариантов анализа этих данных.
Например, на этих гистограммах значения анализа для клеток, обработанных контрольными РНК, позволяют идентифицировать соответствующие ворота для порогового значения каждого анализа. Затем пороговые значения стробирования применяются с помощью импульсного скрипта для маркировки каждой ячейки в исходных данных в соответствии с результатом анализа. Такой подход к маркировке помогает как предварительной, так и визуальной, а также автоматизированной оценке взаимосвязи между лечением и субпопуляционным распределением даже очень больших наборов данных об отдельных клетках.
Например, в этом репрезентативном эксперименте условия нокдауна трех ирнк привели к контрастному распределению клеток относительно ворот в двух анализах. На графиках R метки используются для вычисления процентного распределения ячеек в каждом квадранте. Метки также позволяют сопоставлять дополнительные флуоресцентные измерения с данными анализа.
В этом эксперименте субпопуляции клеток, обработанных шестью SI CDK, были сгруппированы в соответствии с их соответствующими метками анализа и построены в виде гистограмм окрашивания ядерной ДНК. Такое использование меток с клеточными данными позволяет выявить взаимосвязь между двумя анализами клеток и содержанием ДНК в клетках. При выполнении этой процедуры всегда важно помнить о тестировании и корректировке параметров сегментации изображения при использовании профилировщика ячеек.
Это особенно важно при первом использовании новых или непроверенных файлов изображений. Хорошо.
Обзор
В данной статье представлен гибкий информатический рабочий процесс для мультиплексного изображения-основанного анализа флуоресцентно маркированных клеток. Рабочий процесс количественно оценивает ядерные и цитоплазматические маркеры, что позволяет вычислять транслокацию маркеров между этими компартиментами.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Бэкграунд
- Понимание клеточных ответов на генный кнокдаун важно для изучения различных биологических процессов.
- Флуоресцентные маркеры необходимы для визуализации и количественной оценки клеточных компонентов.
- Изображение-основанный анализ предоставляет мощный инструмент для оценки клеточного поведения.
- Нужны надежные методологии для обнаружения маркеров для получения точных результатов.
Цель исследования
- Объективно измерить ответы отдельных клеток на биологические сигналы.
- Количественно оценить интенсивности конкретных флуоресцентных маркеров из микроскопических изображений.
- Анализировать транслокацию маркеров между ядерными и цитоплазматическими компартиментами.
Используемые методы
- Кнокдаун генов посредством siRNA в клетках адгезивной культуры тканей.
- Флуоресцентное окрашивание клеток с последующим изображением для множества маркеров.
- Алгоритмическое определение экспрессии маркеров внутри субклеточных регионов.
- Извлечение и анализ данных с использованием Cell Profiler и R Studio.
Основные результаты
- Успешная количественная оценка интенсивностей ядерных и цитоплазматических маркеров.
- Анализ клеточных ответов на генный кнокдаун через уровни флуоресцентной экспрессии.
- Идентификация субклеточных паттернов транслокации маркеров.
- Генерация детальных файлов данных для значений индивидуальных клеточных анализов.
Выводы
- Рабочий процесс позволяет проводить всесторонний анализ флуоресцентно маркированных клеток.
- Он предоставляет представление о клеточных ответах и регуляторных механизмах.
- Эта методология может быть применена к различным исследованиям, включающим флуоресцентное изображение.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This workflow enables biopharma R&D teams to extract quantitative, single-cell fluorescence data from standard microscope images, supporting mechanistic de-risking in target validation. By quantifying marker translocation and subcellular localization at single-cell resolution, it enhances predictive confidence in early discovery and reduces reliance on population-averaged assays that mask heterogeneous responses. The open-source nature of the pipeline lowers barriers to adoption, promoting reproducibility and cross-functional data sharing across discovery biology and assay development teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking siRNA-mediated gene knockdown to quantitative changes in nuclear/cytoplasmic marker ratios.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data that clarifies pathway activity and functional target engagement beyond bulk measurements.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying subpopulation-specific responses that may indicate differential compound sensitivity or resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative single-cell outputs compatible with high-content screening formats and plate-based perturbation studies.
- Reproducibility: Uses algorithmic segmentation and gating via Cell Profiler to minimize user bias and ensure consistent feature extraction across laboratories.
- Scalability: Processes thousands of cells per well, enabling robust statistical analysis of heterogeneous responses in large-scale siRNA or compound screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links phenotypic screening readouts to mechanistic biomarkers by correlating marker translocation with functional outcomes like cell cycle progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target pathway modulation versus off-target effects through subcellular resolution of signaling dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying the penetrance and uniformity of cellular responses across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative imaging-based phenotyping that informs hit selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic perturbations alter biomarker localization and intensity in defined subcellular compartments.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized single-cell data suitable for Z'-factor calculation and hit confirmation in multiplexed fluorescence assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of subpopulation distributions using gated outputs from Cell Profiler and R-based visualization, facilitating condition-to-condition comparisons.
- Translational Research: Connects imaging phenotypes to downstream validation by preserving single-cell resolution data that can be correlated with orthogonal assays like flow cytometry or Western blot.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable informatics pipeline for multiplexed image analysis that can be adapted across disease models and marker panels without revalidation of core algorithms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing heterogeneous responses and translocation dynamics masked in population averages.
- Operational Value: Promotes standardization through open-source tools (Cell Profiler, R) and defined file-naming conventions that reduce variability across sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content-like analysis on universal fluorescence microscopes, reducing dependency on specialized, high-cost instrumentation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying the consistency and depth of target engagement across genetic or chemical perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image-based assay design, and basic scripting for pipeline execution in Cell Profiler and R Studio.
- Depends on access to fluorescence-capable microscopes and storage infrastructure for managing large TIFF image datasets generated during screening campaigns.
- Necessitates cross-team agreement on image naming conventions, segmentation parameters, and gating thresholds to ensure data comparability across experiments and users.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to new cell types, marker combinations, or subcellular regions of interest, requiring validation of identification and classification modules.
- Practical limitations include reliance on adequate signal-to-noise ratio in fluorescence channels and the need for optimization of illumination and exposure settings to prevent saturation or bleed-through.
