Workflow для высокого содержания, отдельная клетка количественной флуоресцентных маркеров из Всеобщей микроскоп данных, поддерживаемые ПО с открытым кодом
16 декабря 2014 г.
Представлен гибкий информатика рабочий позволяя мультиплексированных на основе образа анализ флуоресцентно меченых клеток. Рабочий процесс количественно ядерных и цитоплазматических маркеров и вычисляет маркер перемещение между этими отсеками. Процедуры предназначены для возмущения клеток с использованием миРНК и надежную методику для обнаружения маркера путем непрямой иммунофлуоресценции в форматах 96-а.
Общая цель этой процедуры заключается в объективном измерении реакции отдельных клеток путем количественной оценки интенсивности специфических флуоресцентных маркеров на изображениях микроскопа. Это достигается путем предварительного подвергнутия адгезивных клеток культуры тканей нокдауну, опосредованному ирнками. На втором этапе клетки окрашивают флуоресцентно, а затем визуализируют на наличие нескольких интересующих их маркеров.
На заключительном этапе экспрессия маркеров в конкретных субклеточных областях определяется алгоритмически, представляя собой отдельные клетки. В конечном счете, клеточные реакции на биологические сигналы от нокдауна генов могут быть проанализированы путем измерения уровней флуоресцентной экспрессии интересующих маркеров и их субклеточной транслокации. Тем не менее, эта процедура дает представление о регуляции транзита G одного клеточного цикла в ответ на миРНК.
Он также может быть применен для исследований, генерирующих изображения флуоресцентных клеток, изучающих ядерный транспорт и белковый гомеостаз. Демонстрировать процедуру будут Даниэль Век и Кар К ХО, постдоки из моей лаборатории Бегин, диспенсировав 70 микролитров 200 наномолярных ирнк, разведенных в буфере ирнк в соответствующие лунки стерильного 96-луночного планшета в шкафу для стерильных культур тканей. Затем добавьте 105 микролитров трансфекционного липида, разведенного в 40 объемах сыворотки свободной среды DMEM, в каждую лунку перемешайте пластину путем слабой вибрации комнатной температуры, а затем через 10 минут разделите полученные 175 микролитров на три репликации по 50 микролитров на каждую мишень в непрозрачную тканевую культуру, обработанную 96 лункой планшета с прозрачным основанием.
Затем диспенсируйте 8 000 клеток на лунку в 150 микролитрах DMEM с 10%-ной сывороткой непосредственно на 50 микролитров комплексов липидных ирнк без смешивания. Затем запечатайте пластину стерильной клейкой дышащей мембраной и поместите пластину во увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 48 часов отсасывают среду из планшетов.
Затем зафиксируйте ячейки в 100 микролитрах 4%-ного буферного формальдегида в вытяжном шкафу при комнатной температуре Через 10 минут аспирируйте фиксатор и выполните три промывки по 100 микролитров PBS после последней промывки. Удалите PBS и перфорируйте клетки тремя циклами инкубации раствора по 100 микролитров по 10 минут каждый при комнатной температуре без встряхивания. После последней инкубации удалите проникающий раствор и затем добавьте 100 микролитров блочного раствора на лунку в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем аспирируйте блочный раствор и зондируйте клетки 50 микролитрами первичного представляющего интерес антитела в течение двух недель после мечения с помощью конфокального микроскопа uc с объективом 20 x для получения отдельных 16-битных изображений TIFF в оттенках серого в трех каналах, соответствующих ДНК-красителю GFP и иммуноокрашиванию. Flora fours захватывает множество неперекрывающихся наборов изображений или кадров для получения изображения примерно от 1000 до 2000 клеток на лунку. Систематическое именование файла изображения с использованием метаданных таким образом, чтобы каждое имя файла представляло собой уникальную комбинацию названия эксперимента, адреса скважины, номера кадра и идентификатора канала.
Затем откройте программу профилирования ячеек и нажмите «Файл и импорт конвейера». Затем в разделе «Из файла» выберите файл трехканального конвейера CP Pipe, который содержит необходимые инструкции для программного обеспечения по интерпретации метаданных файла изображения из сохраненного имени файла Convention Cell Profiler теперь можно использовать для сопоставления изображений, извлечения интенсивности ядерной ДНК и антител из файлов и использования канала GFP для расчета соотношения интенсивности ядерной и цитоплазмы. Для каждой обнаруженной ячейки нажмите кнопку просмотра параметров вывода, а затем выберите входные и выходные папки по умолчанию.
Выбор местоположения файлов изображений для анализа и места назначения извлеченных данных соответственно. Затем в окне модулей анализа щелкните соответствующие значки глаз, чтобы наблюдать за окнами идентификации первичных объектов и третичных объектов во время анализа, и нажмите кнопку Анализировать изображения, когда анализ будет завершен. Нажмите OK в окне сообщения и перейдите в папку вывода по умолчанию Location, где все файлы данных сохраняются в виде файлов значений, разделенных запятыми.
Чтобы выполнить извлечение данных, найдите новый файл CSV для ядер, включенный в выходные данные клеточного профилографа, который содержит данные об отдельных клетках для интенсивности флуоресцентных ядерных антител, интенсивности ядерной ДНК и значений соотношения двух репортеров GFP CDK. Скопируйте предоставленный файл сценария пульса в классификатор ходьбы PL в ту же папку, что и файл данных CSV ядер. Затем дважды щелкните значок Pearl Script.
И когда появится запрос, введите полное имя файла данных, за которым следует имя файла DOT CSV для файла, в котором клетки должны быть закрыты, и значения затвора для флуоресценции антител и двух репортерных данных G FP CDK. Убедитесь, что только что созданный файл сочетает в себе исходные значения анализа отдельных клеток из исходного профиля клеток данных с метками субпопуляций, показывающими, как каждая клетка из каждой лунки работает против обоих вентилей. Теперь откройте программное обеспечение R Studio, чтобы построить график данных для каждого экспериментального условия с использованием меток отдельных субпопуляций клеток, щелкнув «Файл» и «Открыть файл», а затем выбрав предоставленный файл анализа dot r.
Введите адрес компьютера папки, содержащей закрытые данные, включая букву диска и имя самого файла. Затем выделите линии от первой до 17 в верхнем левом окне нашей студии и нажмите на кнопку запуска, чтобы ввести пороговые значения экспериментальных данных и детали местоположения скважины. Наконец, выделите отдельные блоки оставшегося кода под строкой 17 и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы создать соответствующие графики.
Понаблюдайте за графиками в окне в правом нижнем углу нашей студии, а затем нажмите кнопку экспорта, чтобы сохранить их в различных форматах. Описанный здесь рабочий процесс анализирует изображения флуоресцентного микроскопа для получения исходных данных в виде списка с подробным описанием каждой идентифицированной клетки и соответствующими значениями анализа. Существует множество вариантов анализа этих данных.
Например, на этих гистограммах значения анализа для клеток, обработанных контрольными РНК, позволяют идентифицировать соответствующие ворота для порогового значения каждого анализа. Затем пороговые значения стробирования применяются с помощью импульсного скрипта для маркировки каждой ячейки в исходных данных в соответствии с результатом анализа. Такой подход к маркировке помогает как предварительной, так и визуальной, а также автоматизированной оценке взаимосвязи между лечением и субпопуляционным распределением даже очень больших наборов данных об отдельных клетках.
Например, в этом репрезентативном эксперименте условия нокдауна трех ирнк привели к контрастному распределению клеток относительно ворот в двух анализах. На графиках R метки используются для вычисления процентного распределения ячеек в каждом квадранте. Метки также позволяют сопоставлять дополнительные флуоресцентные измерения с данными анализа.
В этом эксперименте субпопуляции клеток, обработанных шестью SI CDK, были сгруппированы в соответствии с их соответствующими метками анализа и построены в виде гистограмм окрашивания ядерной ДНК. Такое использование меток с клеточными данными позволяет выявить взаимосвязь между двумя анализами клеток и содержанием ДНК в клетках. При выполнении этой процедуры всегда важно помнить о тестировании и корректировке параметров сегментации изображения при использовании профилировщика ячеек.
Это особенно важно при первом использовании новых или непроверенных файлов изображений. Хорошо.
Обзор
В данной статье представлен гибкий информатический рабочий процесс для мультиплексного анализа изображений флуоресцентно меченных клеток. Данный рабочий процесс позволяет количественно определить ядерные и цитоплазматические маркеры, что дает возможность вычислять транслокацию маркеров между этими компартментами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретические основы
- Понимание клеточных реакций на нокдаун генов имеет решающее значение для изучения различных биологических процессов.
- Флуоресцентные маркеры необходимы для визуализации и количественного определения клеточных компонентов.
- Анализ на основе изображений представляет собой мощный инструмент для оценки поведения клеток.
- Для получения точных результатов необходимы надежные методики детектирования маркеров.
Цель исследования
- Для объективного измерения ответов отдельных клеток на биологические стимулы.
- Для количественного определения интенсивности специфических флуоресцентных маркеров на микроскопических изображениях.
- Для анализа транслокации маркеров между ядерным и цитоплазматическим компартментами.
Используемые методы
- siRNA-опосредованный нокдаун генов в адгезивных клетках культур тканей.
- Флуоресцентное окрашивание клеток с последующей визуализацией нескольких маркеров.
- Алгоритмическое определение экспрессии маркеров в субклеточных областях.
- Извлечение и анализ данных с использованием Cell Profiler и R Studio.
Основные результаты
- Успешное количественное определение интенсивности ядерных и цитоплазматических маркеров.
- Анализ клеточных ответов на нокдаун генов по уровням флуоресцентной экспрессии.
- Идентификация паттернов субклеточной транслокации маркеров.
- Создание подробных файлов данных со значениями анализов для отдельных клеток.
Выводы
- Данный рабочий процесс позволяет проводить комплексный анализ флуоресцентно меченных клеток.
- Он дает представление о клеточных ответах и регуляторных механизмах.
- Эта методология может быть применена в различных исследованиях, включающих флуоресцентную визуализацию.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Данный рабочий процесс позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики извлекать количественные данные флуоресценции на уровне отдельных клеток из стандартных микроскопических изображений, что способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней. Количественная оценка транслокации маркеров и субклеточной локализации с разрешением до одной клетки повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска и снижает зависимость от анализов, усредненных по популяции, которые маскируют гетерогенные ответы. Открытый исходный код конвейера обработки данных облегчает его внедрение, способствуя воспроизводимости и кросс-функциональному обмену данными между группами по поиску биологических мишеней и разработке анализов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая нокдаун генов с помощью siRNA с количественными изменениями соотношения ядерных и цитоплазматических маркеров.
- Практическая ценность: предоставляет данные с разрешением на уровне отдельных клеток, что позволяет уточнить активность сигнальных путей и функциональное взаимодействие с мишенями, выходя за рамки измерений общих популяций.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля препаратов путем выявления специфических ответов отдельных субпопуляций, которые могут указывать на дифференциальную чувствительность к соединениям или механизмы резистентности.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных на уровне отдельных клеток, совместимых с форматами высокопроизводительного скрининга и исследованиями возмущений на планшетах.
- Воспроизводимость: использует алгоритмическую сегментацию и гейтирование с помощью Cell Profiler для минимизации субъективности пользователя и обеспечения согласованного извлечения признаков в разных лабораториях.
- Масштабируемость: позволяет обрабатывать тысячи клеток в каждой лунке, что обеспечивает надежный статистический анализ гетерогенных ответов в крупномасштабных скринингах с использованием siRNA или соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает результаты фенотипического скрининга с механистическими биомаркерами путем корреляции транслокации маркеров с функциональными исходами, такими как прогрессия клеточного цикла.
- Снижение механистических рисков: позволяет определить, являются ли наблюдаемые фенотипы результатом модуляции целевого пути или следствием нецелевых эффектов, за счет субклеточного разрешения динамики сигналинга.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: обеспечивает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе данных путем количественной оценки пенетрантности и однородности клеточных ответов при различных условиях терапии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая количественное фенотипирование на основе визуализации, которое служит основой для отбора хитов и последующего изучения механизмов действия.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез путем измерения того, как генетические возмущения изменяют локализацию и интенсивность биомаркеров в определенных субклеточных компартментах.
- Скрининг: Предоставляет нормализованные данные по отдельным клеткам, готовые для анализа, которые подходят для расчета Z'-фактора и подтверждения попаданий в мультиплексных флуоресцентных анализах.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение распределений субпопуляций с использованием гейтированных выходных данных Cell Profiler и визуализации на базе R, что облегчает сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает фенотипы визуализации с последующей валидацией, сохраняя данные с разрешением до отдельной клетки, которые могут быть коррелированы с ортогональными методами анализа, такими как проточная цитометрия или вестерн-блоттинг.
- Корпоративное повторное использование: Создает переиспользуемый информационный конвейер для мультиплексного анализа изображений, который может быть адаптирован для различных моделей заболеваний и панелей маркеров без повторной валидации основных алгоритмов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени, выявляя гетерогенные ответы и динамику транслокации, которые маскируются при усреднении по популяции.
- Операционная ценность: способствует стандартизации за счет использования инструментов с открытым исходным кодом (Cell Profiler, R) и определенных правил именования файлов, что снижает вариабельность между различными центрами.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить анализ по типу высококонтентного анализа на универсальных флуоресцентных микроскопах, что снижает зависимость от специализированного дорогостоящего оборудования.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков путем количественной оценки согласованности и глубины взаимодействия с мишенью при генетических или химических воздействиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией, проектированием анализов на основе изображений и базовое владение скриптами для запуска конвейеров обработки в Cell Profiler и R Studio.
- Необходим доступ к микроскопам с возможностью флуоресцентной визуализации и инфраструктуре хранения для управления большими наборами изображений в формате TIFF, создаваемыми в ходе скрининговых кампаний.
- Требуется согласование между командами правил именования изображений, параметров сегментации и порогов гейтирования для обеспечения сопоставимости данных между различными экспериментами и пользователями.
- При применении рабочего процесса к новым типам клеток, комбинациям маркеров или интересующим субклеточным областям требуются адаптационные меры, включая валидацию модулей идентификации и классификации.
- Практические ограничения включают зависимость от надлежащего соотношения сигнал/шум в флуоресцентных каналах, а также необходимость оптимизации параметров освещения и выдержки для предотвращения насыщения сигнала или перекрестного загрязнения каналов.
