Метод мультиплексного иммуноокрашивания с использованием первичных антител от одного и того же вида хозяина

Возьмите фиксированный и проникающий отдел надпочечников, состоящий из коры и мозгового вещества. Обработайте его кипящим кислотным буфером, разорвав индуцированные фиксацией сшивки для демаскировки антигена.

Блокируйте неспецифические сайты связывания и вводите первичные антитела, связывающиеся с корково-специфичными маркерами.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, нацеленные на первичные антитела, и стрептавидин-конъюгированные пероксидазы, связывающиеся с биотином.

Введите тирамид с флуорофорной меткой и перекись водорода.

Иммобилизованные пероксидазы используют перекись водорода для активации тирамида, который связывается с близлежащими белками, маркируя кору головного мозга.

Далее обработайте срез кипящим буфером, чтобы удалить связанные антитела.

Ввести те же первичные антитела, генерируемые видом хозяина, нацеленные на медуллоспецифичные маркеры и биотинилированные вторичные антитела.

Введите стрептавидин-конъюгированные пероксидазы и другой флуорофор-конъюгированный тирамид для маркировки мозгового вещества.

Удаление первичных антител, специфичных для коры головного мозга, ингибирует повторно введенные вторичные антитела, связывающие их, предотвращая перекрестную реактивность.

Нанесите ядерное окрашивание и выполните визуализацию, чтобы визуализировать отчетливо окрашенную кору и мозговое вещество, подтверждающие отсутствие перекрестной реактивности антител.

Перед окрашиванием депарафинизируйте и регидратируйте затвердевшие формалином и парафином предметные стекла с пятиминутным погружением в каждый раствор, как указано. После второго погружения в дистиллированную воду поместите предметные стекла в 275 миллилитров кипящего раствора цитрата натрия на дно коробки с наконечником для пипетки с крышкой и поместите коробку в микроволновую печь мощностью 700 Вт на 70% мощности.

По окончании обработки откройте крышку и дайте раствору остыть до комнатной температуры, прежде чем промыть предметные стекла тремя пятиминутными промывками свежего PBST в банке Coplin. Чтобы заблокировать любые неспецифические места связывания, после последней промывки стряхните излишки PBST с каждого предметного стекла и накройте предметные стекла достаточным объемом соответствующего блокирующего раствора.

Через 30 минут при комнатной температуре во влажной камере встряхните избыток блокирующего раствора с каждого предметного стекла и добавьте 250 микролитров первого первичного антитела, представляющего интерес, в каждый образец. Чтобы образцы не высыхали, предметные стекла могут быть накрыты куском парафиновой пленки.

После ночной инкубации при температуре четыре градуса Цельсия в увлажненной камере трижды промойте предметные стекла свежим PBST в течение пяти минут за промывку. Стряхните излишки PBST, затем быстро накройте каждое предметное стекло 250 микролитрами соответствующего раствора вторичных антител для часовой инкубации в увлажненной камере при комнатной температуре.

В конце инкубации трижды промойте предметные стекла в свежем PBST, как показано на рисунке, и добавьте 250 микролитров свежеприготовленной стрептавидиновой пероксидазы хрена в каждое предметное стекло. Через 30 минут при комнатной температуре трижды промойте слайды в свежем ПБСТ, затем стряхните излишки ПБСТ и залейте каждое слайд 250 микролитрами свежеприготовленного раствора фторофорного тирамида.

Через минуту погрузите слайды в свежий PBST, а затем три двухминутных промывки в свежий PBST. После последнего промывания нанесите на срезы несколько капель глицерина 1-к-1 в растворе PBS, и проверьте наличие флуоресцентного сигнала методом флуоресцентной микроскопии.

Чтобы удалить первый комплекс антител, поместите меченые антителами предметные стекла в 275 миллилитров кипящего раствора цитрата натрия на срок не менее восьми минут, как показано на рисунке. В конце обработки откройте крышку и дайте раствору остыть до комнатной температуры, перед тем как трижды промыть предметные стекла PBST в течение пяти минут за одну стирку.

Чтобы окрашивать второй целевой белок, представляющий интерес, после демонстрации блокировки для неспецифического связывания, пометьте каждый образец 250 микролитрами второго первичного антитела, представляющего интерес, при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующее утро промойте предметные стекла три раза в течение пяти минут в свежем PBST за промывку, прежде чем покрыть каждое предметное стекло 250 микролитрами соответствующего раствора вторичных антител для одночасовой инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации трижды промойте предметные стекла в свежем PBST, как показано на рисунке, и добавьте 250 микролитров свежеприготовленной стрептавидиновой пероксидазы хрена в каждое предметное стекло. Чтобы получить сигнал для второго целевого белка, представляющего интерес, после трех промываний PBST, обрабатывайте предметные стекла флюорофор-конъюгированным тирамидом в другом флуоресцентном спектре.

Чтобы остановить развитие тирамидного сигнала, погрузите предметные стекла в PBST, а затем окрасьте образцы соответствующим ядерным красителем.