Метод мультиплексного иммуноокрашивания с использованием первичных антител от одного и того же вида хозяина

Возьмите фиксированный и проникающий отдел надпочечников, состоящий из коры и мозгового вещества. Обработайте его кипящим кислотным буфером, разорвав индуцированные фиксацией сшивки для демаскировки антигена.

Блокируйте неспецифические сайты связывания и вводите первичные антитела, связывающиеся с корково-специфичными маркерами.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, нацеленные на первичные антитела, и стрептавидин-конъюгированные пероксидазы, связывающиеся с биотином.

Введите тирамид с флуорофорной меткой и перекись водорода.

Иммобилизованные пероксидазы используют перекись водорода для активации тирамида, который связывается с близлежащими белками, маркируя кору головного мозга.

Далее обработайте срез кипящим буфером, чтобы удалить связанные антитела.

Ввести те же первичные антитела, генерируемые видом хозяина, нацеленные на медуллоспецифичные маркеры и биотинилированные вторичные антитела.

Введите стрептавидин-конъюгированные пероксидазы и другой флуорофор-конъюгированный тирамид для маркировки мозгового вещества.

Удаление первичных антител, специфичных для коры головного мозга, ингибирует повторно введенные вторичные антитела, связывающие их, предотвращая перекрестную р