Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Общая цель данной процедуры — определение аффинности связывания при взаимодействии белка с лигандом без предварительной очистки белка из клеточного лизата. Для этого сначала проводят экспрессию интересующего белка, слитого с GFP, в любой адгезивной клеточной линии. После подготовки клеточного лизата и разведений лиганда готовят смеси клеточного лизата с лигандом и загружают их в капилляры.

Затем измеряют термофорез белка, слитого с GFP, при различных концентрациях лиганда. Заключительным этапом является анализ данных микромасштабного термофореза (MST). В конечном итоге микромасштабный термофорез используется для определения аффинности связывания при взаимодействии белков, слитых с GFP, с различными лигандами.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как титрование, калориметрия или поверхностный плазмонный резонанс, является то, что он позволяет избежать очистки белков, что значительно упрощает и ускоряет количественную характеристику бинарных взаимодействий. Этот метод дает существенные преимущества при работе с белками, которые трудно экспрессировать и очищать, такими как мембранные белки и факторы транскрипции. Одним из главных преимуществ микромасштабного термофореза заключается в том, что он работает в различных буферах и допускает присутствие в системе детергентов и целых клеток. Технику продемонстрирует Карен Стефка, биолог из моей лаборатории. Для начала кратко промойте клетки ледяным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), используя 10 мл буфера на одну колбу T 75.

Выдержите клетки на льду в течение пяти минут или до тех пор, пока они не начнут отделяться от стенки флакона. При необходимости используйте скребок для клеток, чтобы полностью их отделить. Ресуспендируйте клетки в 10 milliliters ледяного PBS и перенесите в предварительно охлажденную центрифужную пробирку с круглым дном объемом 14 milliliters.

Осадите клетки путем центрифугирования при 400–600 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 microliters ледяного лизирующего буфера. Перенесите суспензию в предварительно охлажденную пробирку типа «эппендорф» объемом 1.5 milliliter для экстракции цитозольных белков.

Поместите клетки на лед, чтобы минимизировать локальный перегрев, и лизируйте их тремя десятисекундными импульсами ультразвуковой обработки при амплитуде 30%. Используя предварительно охлажденный наконечник диаметром от двух до трех миллиметров, удерживайте его ниже поверхности жидкости, чтобы минимизировать пенообразование. Пропустите этот этап при использовании буфера, содержащего детергент, и инкубируйте на льду в течение 30 минут.

Вместо этого, при необходимости, доведите концентрацию солей в растворе лизата до физиологической концентрации хлорида натрия 100 millimolar, используя стоковый раствор хлорида натрия пяти molar. В завершение соберите лизаты путем центрифугирования при температуре четыре degrees Celsius и ускорении около 25, 000 Gs в течение 10 минут. На приборе MST выберите в качестве источника возбуждения светоизлучающий диод (LED) с длиной волны 470 nanometers.

Заполните капилляры клеточным экстрактом, разведенным в буфере MST в 2 и 10 раз, и поместите их в прибор для MST. Выполните операцию поиска капилляров (find capillaries) в управляющем программном обеспечении прибора MST. Оптимальный диапазон флуоресценции в разведенном лизате составляет от 400 до 1500 единиц флуоресценции.

Перейдите к определению оптимального диапазона концентрации лиганда, как описано в текстовом протоколе. Поместите на лед штатив с необходимым количеством центрифужных пробирок объемом 0.5 мл с низким уровнем связывания; внесите пипеткой 25 µL буфера для MST на дно каждой пробирки, добавьте 25 µL исходного раствора лиганда в первую пробирку и выполните серийное двукратное разведение лиганда с использованием остальных пробирок. Держите штатив с образцами лиганда на льду.

Рассчитайте разведение клеточного лизата для достижения оптимального уровня флуоресцентного белка-мишени в реакциях связывания. Конечная концентрация белка должна быть близка к ожидаемой константе диссоциации связывания или ниже ее, и должна быть скорректирована для получения необходимого количества отсчетов флуоресценции. В конечном растворе разведите клеточный лизат буфером для MST.

Поместите пробирки объемом 0.5 мл с низким уровнем связывания в штатив напротив пробирок с образцами серийного разведения лиганда. Осторожно добавьте 15 µL клеточного лизата на дно каждой пробирки. Старайтесь не касаться стенок пробирки, чтобы избежать потери образца.

Добавьте 15 µL образца лиганда с самой высокой концентрацией в соответствующую пробирку. Номер один, с клеточным лизатом. Тщательно перемешайте и замените наконечник пипетки.

Повторите этот шаг для остальных пробирок, за исключением последней, которая не должна содержать лиганда. Добавьте 15 µL буфера MST в последнюю пробирку и перемешайте. Заполните примерно на две трети первый капилляр смесью для связывания из пробирки номер один.

Наклоните его, чтобы переместить раствор к центру, и поместите капилляр в соответствующую позицию на лотке для капилляров. Позиция номер один; повторите этот шаг с остальными капиллярами. Для более длительных экспериментов концы капилляров можно закупорить воском.

Поместите кювету в прибор MST и закройте дверцу прибора. Затем выберите источник возбуждения СИД с длиной волны 470 нанометров. В приборе MST выполните команду поиска капилляров (find capillaries), чтобы прибор определил точное положение капилляров и измерил флуоресценцию образцов на основе интенсивности флуоресцентного сигнала.

Отрегулируйте мощность Светодиода (LED), чтобы она находилась в диапазоне от 400 до 1500 единиц. Нажмите кнопку «start» для проведения эксперимента по определению терморезистентности. Для эксперимента можно выбрать несколько значений мощности инфракрасного лазера.

Для поиска оптимального температурного градиента для данной конкретной системы требуется от 10 до 12 минут на один прогон набора из 16 капилляров. Соберите данные за два-три прогона для одного и того же набора капилляров, чтобы обеспечить воспроизводимость измерений. Для начала анализа данных откройте программное обеспечение для анализа и загрузите папку проекта.

В открывшемся окне просмотра данных выберите терморетические кривые, полученные при определенной мощности ИК-лазера. Существовал вариант одновременного открытия всех терморетических трейсов, собранных при различных условиях, с последующим выбором любых кривых для анализа путем их включения и выключения. В окне графика точек оценки выберите терморезис или термофорез с синими и красными линиями Т-скачка.

Определите два участка экспериментальных кривых, которые будут выбраны вручную для анализа программным обеспечением. Убедитесь, что синяя и красная линии расположены правильно для обеспечения максимального изменения Thermo Resis. Чтобы получить усредненные значения со стандартными отклонениями, выберите «use average» (использовать среднее) или «distinguish runs» (разделить серии) для отдельных серий измерений.

Чтобы построить график аппроксимации константы диссоциации, выберите «use average» (использовать среднее), введите и зафиксируйте значение концентрации меченой молекулы, а затем проведите аппроксимацию кривой. Значение константы диссоциации связывания или KD вместе со стандартным отклонением отобразится в отдельном информационном всплывающем окне. Сохраните данные средней аппроксимации в текстовом файле и перенесите их в Excel.Heck.

Клетки 2 9 3, экспрессирующие STAT 3G FP, использовались в качестве источника флуоресцентно меченного stat three. В анализе связывания с ДНК связывание высокозаряженных олигонуклеотидов приводило к значительным изменениям подвижности STAT three. В температурном градиенте.

Сигнал терморетического анализа отложен в зависимости от концентрации олигонуклеотидов. Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех измерений. Для аппроксимации данных и определения кажущихся значений KD использовалось программное обеспечение Nano temporal analysis.

Кажущиеся константы диссоциации составили 37,9 ± 1,0 µM для связывания с GAS-мотивом и 23,3 ± 0,6 µM для связывания с AT-богатым олигонуклеотидом s+100. Удивительно, но последовательности s+100 продемонстрировали несколько более сильное связывание, чем GAS. В трех повторностях измерений замена A на G привела к резкому снижению аффинности мутанта s+100 один.

В то время как мутант s плюс 100 два не показал обнаруживаемого связывания, что подтверждает селективность связывания STAT three с s плюс 100, при должном исполнении данная методика может быть реализована менее чем за два часа после того, как она будет освоена. При выполнении этой процедуры важно помнить, что оптимальные условия экстракции мембранных белков будут различаться для разных белков и обычно требуют оптимизации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определить аффинность связывания белка с лигандом без очистки белка из клеточного лизата.