Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Общая цель этой процедуры заключается в определении аффинности связывания взаимодействия белкового лиганда без очистки белка от клеточного лизата. Это достигается путем первичной экспрессии представляющего интерес слитого белка GFP в любой адгезивной клеточной линии. После приготовления клеточного лизата и разведений лигандов готовят смеси клеточных лизатных лигандов и загружают их в капилляры.

Затем измеряют терморезиссионное воздействие слитого белка GFP в присутствии различных концентраций лигандов. Заключительным этапом является анализ данных микромасштабных измерений термофереза или MST. В конечном счете, микромасштабный терморезис используется для определения аффинности связывания взаимодействий между слитыми белками GFP и различными лигандами.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как титрование, калориметрия или поверхностное моно плазмы, является то, что он позволяет избежать очистки белка, что значительно упрощает и ускоряет количественную характеристику бинарных взаимодействий. Этот метод дает значительные преимущества при работе с белками, которые трудно экспрессируются и очищаются, такими как мембранные белки и факторы транскрипции. Одним из самых больших преимуществ микромасштабного термоферезиса является то, что он работает в различных буферах и допускает присутствие детергентов и клеток в системе.

Держите клетки на льду в течение пяти минут или до тех пор, пока они не начнут отделяться от колбы. Соскребите ячейки скребком, чтобы при необходимости отсоединить. Повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитров ледяного PBS и переложите в предварительно охлажденную 14-миллилитровую центрифугу с круглым дном.

Гранулируйте клетки центрифугированием при температуре от 400 до 600 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах ледяного буфера для лизиса. Перенесите суспензию в предварительно охлажденную эйноровую пробирку объемом 1,5 миллилитра для экстракции цитозольных белков.

Поместите элементы на лед, чтобы свести к минимуму локальный перегрев, и добавьте три десятисекундных импульса ультразвуковой обработки с амплитудой 30%. Используя двух-трехмиллиметровый наконечник для предварительного охлаждения, держите наконечник ниже поверхности, чтобы свести к минимуму вспенивание. Пропустите этот шаг при использовании буфера, содержащего моющее средство, и инкубируйте на льду в течение 30 минут.

Вместо этого откорректируйте раствор лизата так, чтобы он содержал физиологическую концентрацию соли в 100 миллимоляров хлорида натрия, если это необходимо, из исходного раствора из пяти моляров хлорида натрия. Наконец, соберите лизаты центрифугированием при температуре около 25 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выберите светодиод или источник возбуждения светодиодов с длиной волны 470 нанометров на приборе MST.

Загрузите капилляры с экстрактом клеток, разведенными в два и 10 раз, с помощью буфера MST и поместите их в инструмент MST. Выполните операцию поиска капилляров в управляющем программном обеспечении прибора MST. Оптимальный диапазон флуоресценции в разбавленном лизате составляет от 400 до 1500 флуоресцентных единиц.

Приступайте к определению оптимального диапазона концентраций лигандов, как описано в текстовом протоколе. Поместите штатив для пробирок с необходимым количеством 0,5 миллилитров центрифужных пробирок с низким связыванием на ледяную пипетку, 25 микролитров буфера MST на дно каждой пробирки, по 25 микролитров стокового раствора лиганда на первую пробирку и проведите последовательное двукратное разведение лиганда с использованием остальных пробирок. Держите штатив с образцами лигандов на льду.

Рассчитайте разведение клеточного лизата для получения оптимального уровня флуоресцентного целевого белка в реакциях связывания. Конечная концентрация белка должна быть близка к ожидаемой константе диссоциации связывания или ниже, и должна быть скорректирована для получения необходимого количества подсчетов флуоресценции. В окончательном растворе продолжайте разбавлять лизат клеток с помощью MST Buffer.

Поместите пробирки объемом 0,5 миллилитра с низким связыванием в штатив для пробирок напротив пробирок с образцами серийного разведения лиганда. Осторожно добавьте на дно каждой пробирки по 15 микролитров клеточного лизата. Старайтесь не прикасаться к стенкам пробирки, чтобы избежать потери пробы.

Добавьте в соответствующую пробирку 15 микролитров образца лиганда с наибольшей концентрацией. Во-первых, с клеточным лизатом. Хорошо перемешайте и поменяйте наконечник пипетки.

Повторите этот шаг с остальными трубками, за исключением последней, которая не должна содержать лиганда. Добавьте 15 микролитров буфера MST в последнюю пробирку и перемешайте. Хорошо заполните примерно две трети первого капилляра связующей смесью из пробирки номер один.

Наклоните его, чтобы переместить раствор к центру, и поместите капилляр на капиллярный лоток в нужное положение. Во-первых, повторите этот шаг с остальными капиллярами. Капиллярные концы можно закупорить воском для более длительных экспериментов.

Поместите лоток внутрь прибора MST и закройте дверцу прибора. Далее выберите источник возбуждения светодиода с длиной волны 470 нанометров. На приборе MST выполните команду «Найти капилляры», чтобы прибор нашел точное положение капилляров и измерил флуоресценцию образцов на основе интенсивности флуоресцентного сигнала.

Отрегулируйте мощность светодиода, чтобы довести ее до интервала от 400 до 1500 единиц. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы выполнить эксперимент Thermo Resis. Для эксперимента можно выбрать более одной мощности инфракрасного лазера.

Для того, чтобы найти оптимальный температурный градиент для конкретной системы, требуется от 10 до 12 минут, чтобы запустить один набор из 16 капилляров. Соберите данные от двух до трех прогонов для одного и того же набора капилляров, чтобы обеспечить воспроизводимость измерений. Чтобы начать анализ данных, откройте программное обеспечение для анализа и загрузите папку проекта.

В появившейся информации прогона просмотрщика выбираются собранные при определенном ИК лазере силовые термореактивные кривые. Появилась возможность открыть сразу все терморетические трассы, собранные в различных условиях, а затем выбрать любые кривые для анализа, включив и выключив их. В окне графика точек оценки выберите терморезис или термоферез с Т-образным скачком, синими и красными линиями.

Определите две области экспериментальных кривых, которые будут выбраны программным обеспечением вручную для анализа. Убедитесь, что синяя и красная линии расположены правильно, чтобы обеспечить максимальное изменение Thermo Resis. Чтобы получить усредненные точки со стандартными отклонениями, выберите Использовать среднее или Различать прогоны для отдельных прогонов.

Чтобы построить график аппроксимации константы диссоциации, выберите Использовать среднее, введите и зафиксировайте значение концентрации помеченной молекулы и подогнайте кривую. Константа диссоциации привязки или значение KD с ее стандартным отклонением отображается в отдельном информационном всплывающем окне. Сохраните данные среднего соответствия в текстовом файле и перенесите в Excel.Heck.

2 9 3 клетки, экспрессирующие STAT 3G FP, использовали в качестве источника флуоресцентно меченного stat 3. Для анализа связывания ДНК А связывание высокозаряженных олигонуклеотидов приводило к значительным изменениям в подвижности трех STAT. В температурном градиенте.

Терморетичный сигнал строится в зависимости от концентрации олигонуклеотидов. Каждая точка данных представляет собой среднее арифметическое трех измерений. Программное обеспечение для нановременного анализа было использовано для подгонки и определения видимых значений KD.

Кажущиеся константы диссоциации составляли 37,9 плюс-минус 1,0 микромоль для связывания с газовым мотивом и 23,3 плюс-минус 0,6 микромоль для связывания с богатым олигонуклеотидом s плюс 100. Удивительно, но s плюс 100 последовательностей показали несколько более плотную связь, чем газовая. При трех повторениях измерений замена A на G привела к резкому снижению аффинности s плюс 100 мутантного единицы.

В то время как s плюс 100 мутант two не показал обнаруживаемого связывания, тем самым подтверждая селективное связывание последовательности STAT 3 с s плюс 100 После освоения этот метод может быть выполнен менее чем за два часа, если он выполнен правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что оптимальные условия для экстракции мембранных белков будут отличаться для разных белков и обычно требуют оптимизации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить аффинность связывания белка с элегантным без очистки белка от клетки. Лизат.