Выделение и культивирование эмбриональных нейронов цыплят на многоэлектрической матрице

Возьмите оплодотворенное куриное яйцо, содержащее эмбрион ранней стадии.

Простерилизуйте скорлупу и осторожно откройте ее.

Извлеките эмбрион. Рассеките и перенесите головку на культуральную пластину, содержащую буфер. Удалите глазное яблоко.

Сделайте разрез и удалите слои кожи, обнажив передний и средний мозг.

Удалите внутренний пленчатый слой и кровеносные сосуды. Рассеките и перенесите передний мозг в культуральную пластину с буфером.

Разрежьте ткань на более мелкие фрагменты и перенесите их в коническую трубку. Как только осядут осядки, удалите буфер.

Добавьте раствор протеолитического фермента. Инкубируйте для переваривания внеклеточного матрикса ткани и ослабления нейронов.

Удалите среды, богатые ферментами, промойте нейробазальной средой, удалив остатки ферментов.

Добавьте нейробазальную среду. Механически диссоциируйте ткань для получения нейрональной суспензии.

Поместите эти нейроны в систему многоэлектродной матрицы, покрытую внеклеточным матриксом. Добавьте нейробазальную среду и инкубируйте.

Нейроны присоединяются и удлиняют проекции, образуя нейронную сеть.

В день нанесения нейронов достаньте флакон с внеклеточным матриксом из морозильной камеры при температуре -20 градусов Цельсия. Сбрызните 70% этанолом и положите на лед. Обязательно разморозьте внеклеточный матрикс на льду. Не размораживайтесь при комнатной температуре, так как ЭХМ полимеризуется при температуре выше 0 градусов Цельсия.

Работа в вытяжке BSL-2 для разбавления внеклеточного матрикса до 25% путем добавления 300 микролитров холодной нейробазальной среды к 100-микролитрам аликвоты. Затем с помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров 25% раствора внеклеточного матрикса в центр многоэлектродной матрицы, стараясь не касаться электродов. Сразу же снимите ЭСМ, оставив на поверхности тонкую пленку.

Накройте многоэлектродную матрицу и поместите в инкубатор для тканевых культур до тех пор, пока нейроны не будут готовы к нанесению пластин. Начните выделение нейронов цыпленка с стерилизации внешней оболочки яйца E7 с помощью 70% этанола. С этого момента важно поддерживать стерильные условия. Убедитесь, что все инструменты стерилизованы 70% этанолом, а растворы стерильны. Полезно использовать капюшон, но не является абсолютно необходимым для вскрытия, если оно выполняется быстро.

Затем, после извлечения и обезглавливания эмбриона, разрежьте вокруг глаз и удалите глазные яблоки. Затем с помощью тонких щипцов Dumont No 5 и пружинных ножниц сделайте разрез с вентральной стороны и удалите внешние слои кожи, чтобы обнажить передний мозг и тектум зрительного нерва. Осторожно очистите и снимите пленку от кожуры.

Перенесите передний мозг в другую чашку Петри, содержащую HBS, и разрежьте ее на небольшие кусочки размером около 2 миллиметров пружинными ножницами. С помощью стерильной трансферной пипетки перенесите кусочки переднего мозга в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. После того, как кусочки переднего мозга опустятся на дно пробирки центрифуги, удалите как можно больше HBS.

Далее добавьте 1 миллилитр предварительно подогретого 0,5% трипсина-ЭДТА и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. С помощью пастеровской пипетки осторожно удалите трипсин, не потревожив кусочки ткани. Добавьте 1 миллилитр нейробазальной среды и дайте кусочкам ткани опуститься на дно. После удаления среды и повторения промывания добавьте 2 миллилитра нейробазальной среды и осторожно растирайте до тех пор, пока не исчезнут кусочки ткани.

Разбавьте ресуспензированные клетки от 1 до 10 нейробазальной средой и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего красителя и гемоцитометра. После подсчета поместите соответствующие ячейки на многоэлектродные матрицы с покрытием ECM с плотностью 2200 ячеек на квадратный миллиметр.