Двухфотонная микроскопия для визуализации микроциркуляторного русла мозга мыши in vivo

Начните с мыши, находящейся под наркозом, с головной пластиной, закрепленной над хирургически подготовленным кортикальным окном с тонким черепом.

Расположите мышь на спине. Удалите медиальную кожу бедра, чтобы обнажить бедренную вену.

Введите в вену конъюгат флуоресцентного красителя, чтобы пометить плазму крови, что позволит визуализировать кровеносные сосуды.

Зашить разрез.

Переверните мышь и закрепите оголовье в ремне безопасности, чтобы стабилизировать мышь.

Перенесите установку на предметный столик для двухфотонного микроскопа.

Добавьте физиологический раствор поверх коркового окна. Опустите линзу объектива до тех пор, пока она не соприкоснется с физиологическим раствором.

Используя светлопольное освещение, определите местоположение области изображения.

Переключитесь на двухфотонную визуализацию.

Лазер микроскопа фокусирует низкоэнергетический свет ближнего инфракрасного диапазона в мозг.

В фокусной точке лазера два фотона объединяют свою энергию, чтобы возбудить краситель, заставляя кровеносные сосуды флуоресцировать.

Определите капиллярное русло — сеть мелких кровеносных сосудов, соединяющих артерии с венами, — и увеличьте его.

Получение изображений для анализа микроциркуляторного русла мозга.

При этой процедуре удалите кожу на медиальном левом бедре мыши. Далее найдите бедренную вену. С помощью шприца объемом 1 миллилитр и иглы 30 калибра наберите 130 микролитров раствора флуоресцентного красителя. Медленно введите 100 микролитров красителя в бедренную вену.

После извлечения иглы надавите на место инъекции, чтобы остановить кровотечение, и дайте красителю циркулировать в течение пяти минут. Затем закройте место операции швами. Осторожно переверните мышь на живот и поместите ее в жгут для головной панели мыши. Для получения двухфотонной визуализации in vivo переместите хирургический аппарат к двухфотонному микроскопу и убедитесь, что уровень анестезии животного поддерживается.

Затем поместите небольшое количество 0,9% физиологического раствора в резервуар для головной пластины и опустите объектив микроскопа так, чтобы он соприкасался с физиологическим раствором. Затем найдите интересующую вас область с помощью объектива просмотра яркого поля. После этого начните двухфотонную визуализацию. Найдите капиллярное русло на экране просмотра и увеличьте эту область с помощью оптического зума 2. Получение изображений капилляров с помощью программного обеспечения для двухфотонной визуализации.