Визуализация миграции клеток нервного гребня у эмбриона рыбки данио с помощью многофотонной покадровой визуализации

Начните с живого, дехорионированного трансгенного эмбриона данио-рерио, помещенного в агарозу с низкой температурой плавления и помещенного в камеру, заполненную средой для эмбрионов.

Эмбрион экспрессирует усиленные клетки нервного гребня, меченные зеленым флуоресцентным белком (EGFP).

Расположите камеру на предметном столике микроскопа. Используя светлопольное освещение, отрегулируйте объектив для фокусировки и центрирования эмбриона в поле зрения.

Переключитесь на цель погружения в воду и снова сфокусируйтесь на эмбрионе.

Отрегулируйте параметры визуализации для получения изображений Z-стека от латерального до медиального края, захватывая ширину глаза.

Выключите освещение в ярком поле, накройте сцену и включите интервальную съемку.

При необходимости заполняйте камеру фильтрующим материалом во время визуализации.

Под действием лазерного излучения клетки нервного гребня флуоресцируют.

Визуализируйте миграцию этих клеток из нервной трубки в черепно-лицевые области, вокруг развивающегося глаза, чтобы заселить периокулярную мезенхиму и лобно-насальный отросток, и вентрально, чтобы сформировать дуги глотки.

После того, как вся установка будет помещена на столик микроскопа, в соответствии с текстовым протоколом, используйте объектив «Пять раз» для определения местоположения эмбриона. Затем вручную поднимите предметный столик в самое высокое положение и с помощью тонкой фокусировки расположите эмбрион в центре диапазона микроскопа.

Вручную опустите сцену и измените цель «Пятикратное погружение» на цель «Погружение в воду 25 раз». Осторожно поднимите сцену, чтобы вернуть эмбрион в фокус. В программном обеспечении нажмите на режим xyzt для получения нескольких изображений с интервалом времени или t в плоскости xy на глубине z.

Используйте эпифлуоресцентное или светлопольное изображение, чтобы найти глубину резкости в области интереса, которая будет разграничивать z-стек. В этих экспериментах боковой край глаза является началом z-стека. Когда вы сосредоточитесь здесь, в программном обеспечении, нажмите кнопку «Начать». После фокусировки вниз до средней линии эмбриона, которая является концом z-стека, нажмите кнопку «Конец».

Важным шагом является обеспечение того, чтобы шаг z охватывал область интереса. В нашем случае мы хотим захватить ширину глаза от латерального до медиального краев.

Нажмите на меню для настройки времени съемки и частоты съемки. Для адекватного восстановления флуорофора и выживания эмбриона необходимо обеспечить соотношение не менее 1 к 3 между получением z-стека при включенном лазерном питании и временем восстановления при выключенном лазерном питании. При наличии подходящего времени для восстановления эмбрионов установите время между z-стеками и назначенным окном. Затем установите общую продолжительность эксперимента в соответствующем окне.

Теперь включите настройку живого изображения, чтобы внести окончательные корректировки в настройки лазера. Отрегулируйте ползунки пропускания лазера, усиления и смещения в программном обеспечении для оптимизации флуоресцентного изображения. Кроме того, при необходимости корректируйте ориентацию эмбриона в зависимости от продолжительности эксперимента, ожидаемого роста эмбриона и так далее. Убедитесь, что область интереса остается в кадре на протяжении всего эксперимента.

Во время цейтраферной съемки выключите эпифлуоресцентный источник света. Накройте сцену лазерным сейфом, который достаточен для защиты от фонового света. Затем нажмите кнопку «Пуск».

Доступ к открытой камере ванны осуществляется через раздвижные дверцы на лазерном сейфе, чтобы наполнять ее покадровой средой для эмбрионов каждые 8-12 часов. После получения изображения откройте файлы в программном обеспечении для обработки изображений. Выделите правильный ряд изображений.

В программном обеспечении выберите меню «Процесс». Нажмите на 3D Deconvolution и примените для деконволюции каждый z-стек. Импортируйте отдельные файлы TIFF в программное обеспечение для обработки видео. Затем выделите все файлы TIFF и перетащите их в видеоредактор. Отрегулируйте продолжительность каждого изображения в видео до 0,1 секунды. Наконец, экспортируйте видео в виде файла MOV или MP4.