Пептидная микрочиповая технология для профилирования специфичности антител

Возьмите предметное стекло микрочипа, содержащее пептиды гистонов с целевыми и нецелевыми посттрансляционными модификациями или ПТМ.

Пептиды иммобилизуются с помощью конъюгированного биотина в определенных местах на предметном стекле, функционализированном стрептавидином.

Пятна также содержат иммобилизованный зеленый флуорофор, конъюгированный с биотином, что облегчает идентификацию пятен.

Введите блокирующий буфер, предотвращающий взаимодействие неспецифических антител.

Снимите буфер и центрифугу, чтобы высушить предметное стекло.

Внутри воскового импринтера окаймите массив воском.

Уравновесьте массив с помощью буфера гибридизации.

Инкубируйте с первичными антителами, специфичными для целевой ПТМ.

Вводят красные флуорконъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами.

Удалите несвязанные антитела и центрифугой, чтобы высушить предметное стекло.

Сделайте изображение предметного стекла с помощью сканера с микрочипами. Зеленая флуоресценция помогает идентифицировать пятна, в то время как красная флуоресценция указывает на взаимодействие ПТМ и антител, демонстрируя специфичность антител.

Распознавание целевой ПТМ демонстрирует специфичность антител, в то время как распознавание нецелевых ПТМ указывает на перекрестную реактивность антител.

Руководствуясь картой исходной пластины, загрузите от 1 до 2 микролитров каждой пептидной функции в специальные лунки одного или нескольких 384-луночных планшетов малого объема. Разбавьте каждую функцию в десять раз с помощью 1x белкового микрочипового печатного буфера, дополненного 1% бычьего сывороточного альбумина, и 5 микрограммов на микролитр биотина, меченного флуоресцеином. Затем центрифугируйте планшеты при 500 умноженных на г при комнатной температуре в течение 2 минут. Затем опорожните контейнер для отходов принтера с микрочипами. Наполните моющий раствор в емкости увлажнителя стерильной дистиллированной водой. Введите параметры слайда матрицы в программное обеспечение принтера с микрочипами.

Установите процедуру промывки на 1-секундную стирку с однократным погружением, после промывки окуните булавки пять раз, а влажность до 60%. Затем вставьте стеклянные предметные стекла со стрептавидиновым покрытием в плиты подложки. Загрузите плиты в элеватор плит. Вставьте исходные пластины в держатели пластин и загрузите держатели в элеватор исходной пластины. Запустите процесс печати.

Затем снимите подложные плиты с инструмента. Заблокируйте напечатанные слайды с помощью 1x белкового микрочип-блокирующего буфера на 30 минут во время встряхивания. Затем промойте предметные стекла в буферизованном фосфатом солевом растворе комнатной температуры при pH 7,6 в течение 10 минут. Повторите стирку со свежей порцией PBS. Высушите предметные стекла центрифугированием в течение 30 секунд при комнатной температуре.

Затем разогрейте восковой принтер с микрочипом до 85 градусов Цельсия в течение 30 минут или пока воск не растает. Затем вставьте слайд печатной стороной вниз в держатель и совместите держатель с пресс-формой для импринтера. Приведите форму в соприкосновение со слайдом и удерживайте в течение двух секунд. Затем быстро снимите предметное стекло с держателя и осмотрите восковые края, чтобы убедиться, что массивы надежно закрыты. Храните разделительные слайды при температуре 4 градуса Цельсия в сухом, темном месте.

Чтобы начать процедуру гибридизации, поместите предметное стекло с разделенным массивом в пластиковую чашку и накройте предметное стекло буфером для гибридизации. Уравновесьте горку в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, встряхивая на низкой скорости. Высушите предметное стекло, вращая в микрочипе центрифугу для предметных стекол при комнатной температуре. Затем добавьте по 5 микролитров каждого раствора антитела к гистону PTM по крайней мере в две лунки матрицы и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия в течение одного часа.

После инкубации удалите раствор антител и промойте массив холодным PBS три раза, по 5 минут каждый, при температуре 4 градуса Цельсия. Затем инкубируют матрицу в растворе флуоресцентного красителя, конъюгированного вторичным антителом, в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, в отсутствие света. Вымойте предметное стекло три раза холодной PBS, как и раньше.

Опустите решетку в комнатную температуру 0,1x PBS для удаления лишних солей и высушите предметное стекло путем кратковременного центрифугирования при комнатной температуре. Визуализируйте предметное стекло с помощью микрочипового сканера с разрешением не менее 25 микрон.