Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Общая цель этой процедуры заключается в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Первая культура мыши, эмбриональные стволовые клетки на первичных эмбриональных фибробластах мыши и добавка с фактором, ингибирующим лейкемию. Затем усильте процесс нормализации путем добавления ноггина BFG F и FGF 8, чтобы индуцировать спецификацию моторных нейронов путем инкубации с ретиноевой кислотой и разглаженным агонистом, после чего следует удлинение аксонов и созревание моторных нейронов.

Наконец, используйте иммунофлуоресцентную микроскопию для изучения дифференцированных клеток MES, которые экспрессируют сильную флуоресценцию GFP. Генерация большого количества моторных нейронов облегчила исследования заболеваний двигательных нейронов по сравнению с существующими в настоящее время протоколами. Такой подход к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны является более эффективным. Этот метод может дать представление о спинальной мышечной атрофии.

Он также может быть применен при других заболеваниях двигательных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз. Через 30 минут при комнатной температуре сбросить лишнюю жидкость. Теперь разведите один флакон митомицина С в активированном PMEF в 40 миллилитрах медиа-планшета PMEF на четырех планшетах и заквашивайте на срок до одной недели.

Далее разморозьте один флакон с ячейками MES на водяной бане при температуре 37 градусов. Промойте клетки пятью миллилитрами среды E ES в пробирке объемом 15 миллилитров. После центрифугирования при 800 об/мин в течение пяти минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте MES-клетки в 20 миллилитрах ЭС среды со свежедобавленным фактором, ингибирующим лейкоз. Приступайте к удалению 10 миллилитров среды из культур PMEF и замените на 10 миллилитров суспензии трех ES-клеток HBG. Отслеживайте прогрессирование клеток MES с течением времени от небольших колоний через 24 часа до колоний диаметром около 100 микрометров через 72 часа после осаждения.

Ежедневно заменяйте среды для поддержания пролиферации клеток для индукции MES-клеток. Дифференцировка в моторные нейроны. Эмбриональные стволовые клетки мыши должны быть сначала отделены от фидерных клеток PMEF, а затем культивированы в суспензионной среде в день индукции.

Для каждой 100-миллиметровой ЭС культуры приготовьте Т одну 50-миллиметровую колбу, покрытую 0,1%-ным желатином. Через 30 минут при комнатной температуре удалите излишки желатина и трижды промойте PBS. Продолжайте осторожно отсасывать среду из культуры ES, следя за тем, чтобы не вытеснить слабо прикрепленные колонии. Затем умойтесь один раз 10 миллилитров PBS.

Теперь, чтобы отделить клетки MES от PMEF, добавьте три миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА и инкубируйте в течение трех-пяти минут. При температуре 37 градусов Цельсия убедитесь, что стволовые клетки и PMEF отделились от планшета. Затем добавьте 15 миллилитров свежей ЭС среды и разрушьте колонии путем пипетирования.

Перенесите клеточную суспензию в подготовленную покрытую желатином Т одну колбу 50 инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы ВФС прикрепилась к желатинизированной поверхности. Теперь соберите плавающие ячейки MES в 50-миллилитровую пробирку и гранулы методом центрирования. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах нейронной дифференцировки.

Среду перечислите с помощью гемоцитометра, а затем нанесите на 100-миллиметровую суспензию в чашку для культуры по дифференцировке. В первый день убедитесь с помощью микроскопии, что клетки MES образовали небольшие плавающие агрегаты, называемые эмбриональными телами. Поскольку любой перенос PMEF прикреплен к чашке, перенесите элементы суспензии ES и среду в 15-миллилитровую пробирку, после чего центрифугируйте при 500 об/мин в течение трех минут.

Чтобы собрать эмбриональные тела, отсасывайте из среды, осторожно добавьте 10 миллилитров свежей нервной дифференцировки, среды к гранулированным EBS, а затем поместите клетки в новую бактериальную культуру в течение 24 часов на дифференцировку. На второй день переверните чашку для культивирования и переложите среду и EBS в 15-миллилитровую трубку. Дайте ЭБС осесть под действием силы тяжести, затем осторожно отдохните от среды и восстановите суспензию ЭБС и 10 миллилитров дифференцировки моторных нейронов.

Срединная культура EBS в новой бактериальной чашке в течение пяти дней на дифференцировку. На седьмой день убедитесь, что EBS имеет диаметр примерно от 150 до 200 микрометров и передает сильные сигналы GFP при дифференцировании. На пятый день, за два дня до диссоциации EBS, поместите 12-миллиметровые круглые защитные стекла на дно 24-луночного планшета.

Затем добавьте 0,5 миллилитра 100 микрограмм на миллилитр, поли DL орнитин и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Аспирируйте поли DL орнитин на суше на воздухе и покровные стекла в капюшоне для культуры тканей. Промыть пластинчатые лунки двойной дистиллированной водой три раза.

Дайте высохнуть на воздухе, чтобы покрыть покровные стекла. Сделайте свежее разведение двух микрограмм на миллилитр мышиного ламинина на пять миллилитрах холодного льда одним XPBS. Добавьте 0,5 миллилитра на лунку и выдерживайте при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

Дважды постирайте PBS на дифференциацию. На седьмой день соберите EBS в 15-миллилитровую трубку и дайте EBS осесть под действием силы тяжести. После четырех стирок PBS добавьте один миллилитр ACU max в EBS, аккуратно перемешайте и выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аспирируйте избыток ACU max, покрывающий EBS.

Теперь добавьте три миллилитра среды MND и диссоциируйте EBS путем пипетирования примерно 20 раз с помощью микропипетки einor объемом 1 миллилитр, затем инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре, пропустите клеточную суспензию через колпачок клеточного тренажера в пробирку размером 12 на 75 миллиметров. Повторите эту стадию диссоциации с оставшимися комками и клетками, оставленными фильтром, чтобы обогатить выход одиночных клеток в окончательной суспензии одиночных клеток объемом шесть миллилитров. Аккуратно перемешайте одиночную клеточную суспензию и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, разбавьте клетки в полную среду МГП до плотности от двух до 10 до пятых клеток на миллилитровую пластину.

0,5 миллилитра клеточной суспензии на лунку из подготовленных 24 луночных планшетов, содержащих поли DL орнитин ламинин, покрытых покровными стеклами. Дифференцированные клетки удлиняются в течение двух дней. В культуре HBG 3 представляет собой линию ES-клеток, полученную от трансгенной мыши, экспрессирующей EGFP под контролем промотора моторного нейрона HB 9 с определенным протоколом дифференцировки.

Клетки MES могут быть использованы для получения двигательных нейронов. Недифференцированные клетки MES образуют круглые колонии на вершине слоя фидера фибробласта. У них слабое выражение GFP.

Эти MES-клетки отделяли от питающих слоев и культивировали на чашках с низким прикреплением для формирования эмбриональных тел. Дифференцированные MES-клетки экспрессировали сильную флуоресценцию GFP после седьмого дня. Дифференцировочные EBS диссоциировали и наносили на пластины, покрытые поли DL орнитином ламинином.

Дифференцированные клетки выходят длинными нейритами из клеточных тел пластинчатых клеток после двух дней в культуре, моторные нейроны, полученные из клеток MES, могут характеризоваться иммунофлуоресцентным окрашиванием. Эти GFP-положительные клетки экспрессируют нейрофиламент паннейронального маркера и два маркера моторных нейронов. Одно веко и холина ацетилтрансфераза DPI окрашивают ядра, взятые вместе.

Наш двухэтапный протокол дифференцировки обеспечивает эффективный способ дифференцировки MES-клеток в спинномозговые моторные нейроны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание того, как эффективно дифференцировать эмбриональные стволовые клетки мыши в моторные нейроны. В заключение следует отметить, что высокие качества эмбриональных стволовых клеток мыши являются наиболее ответственным параметром для эффективной генерации моторных нейронов.