Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров

Общая цель этой процедуры заключается в получении предшественников корковых интернейронов в предшественниках постмитотических интернейронов для эмбриональных стволовых клеток мыши с использованием модифицированного метода преобразования эмбриоидного тела в монослой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как подтипы корковых интернейронов достигают своей индивидуальной судьбы во время развития. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет эффективно генерировать предшественников интернейронов Nkx2.1, а также обогащать подгруппы интернейронов парвальбумином или соматостатином.

Чтобы начать эту процедуру, поместите митотически неактивные клетки-питатели MEF в среде MEF на планшеты, обработанные культурой тканей. Подождите не менее 12 часов, чтобы они осядли в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем наносить mESCs. Если вы не используете его сразу, заменяйте фильтрующий материал каждые три дня.

Затем добавьте в пластины MEF mESCs, содержащие фактор ингибирования лейкоза мышиного лейкоза. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Пропускайте mESCs с помощью trypsin-EDTA, как только чашка становится сливающейся на 70–80%, и поддерживайте mESCs на слое питателя MEF в средах mESC для поддержания плюрипотентности.

Прежде чем начать дифференцировку, пропустите клетки по крайней мере один раз на пластины, покрытые желатином, без MEF, чтобы разбавить их. Для этого приготовьте покрытые желатином пластины, добавив 0,1% желатина и PBS с кальцием и магнием в чашку, обработанную культурой тканей, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 1 часа. Пластину от 1,5 до двух умножить на 10 на шестую клетку на каждой десятисантиметровой пластине и позволить им расшириться в течение двух дней до начала дифференцировки.

На DD0, после того как mESCs выросли на пластинах, покрытых желатиновым покрытием, в течение двух дней, отсасывайте среду и промойте клетки один раз PBS без кальция и магния. Затем добавьте достаточное количество трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть поверхность пластин. И поместите клетки обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на четыре минуты.

Через четыре минуты угасите трипсин-ЭДТА, используя в два раза больше среды mESC. Переложите ячейки в центрифужную пробирку соответствующего размера и центрифугируйте ячейки при 200-кратном g в течение пяти минут. Далее снимите трубку и аспирируйте среду, не нарушая гранулы.

Ресуспендировать гранулу в одном миллиметре среды KSR-N2. Впоследствии измерьте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра, или автоматизированного счетчика клеток. Начните выращивание клеток в качестве эмбриоидных тел, добавив 75 000 клеток на миллилитр в среду KSR-N2 в чашки для культивирования тканей без адгезивных культур.

И инкубировать их при температуре 37 градусов по Цельсию. На DD1 подготовьте к посадке клеток, покрыв обработанные культурой тканей чашки поли-L-лизином в течение не менее одного часа или в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На DD2 аспирируйте поли-L-лизин и покройте пластины ламинином на ночь при температуре 37 градусов Цельсия.

На DD3 перед началом диссоциации EB аспирируйте ламинин и дайте планшетам полностью высохнуть в вытяжке для культуры тканей. После этого переложите БЭ вместе со средой в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в течение трех-четырех минут при 15-умножденной плотности g или пока БЭ не начнут гранулироваться. Отсадите среду, и добавьте три миллилитра раствора для отслойки клеток, содержащего ДНКазу.

Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Осторожно переворачивайте трубку каждые три минуты, чтобы способствовать диссоциации БЭ. Как только БЭ перестанут быть видимыми или пройдет 15 минут, добавьте шесть миллилитров KSR-N2, содержащей ДНКазу, и центрифугируйте в течение пяти минут при 200-кратном избытке.

Затем поместите клетки в KSR-N2, содержащие LDN193189, XAV939, и ингибитор ROCK, Y27632, в соотношении от 4,5 до пяти умножить на десять до четырех клеток на квадратный сантиметр. На DD5 смените носитель на KSR-N2, содержащий FGF2, IGF1 и SSH. Затем подготовьте планшеты для культивирования тканей для повторного посева на 8-й день, используя инструкции, изложенные в процедурах на DD1 и DD2.

На DD7 смените носитель на KSR-N2, содержащий FGF2, IGF1 и SHH. На DD8 перепланируйте клетки, отделив их от планшетов с помощью трипсин-ЭДТА на пять минут при температуре 37 градусов Цельсия. Гасите трипсин-ЭДТА, используя в два раза больше его объема с помощью KSR-N2.

И центрифугировать при 200 умноженных на g в течение пяти минут. Отфильтруйте элементы через фильтрующую трубку 40 микрон, чтобы удалить комки. Затем перепланируйте клетки с углом 250 000 клеток на квадратный сантиметр в N2-KSR, содержащем FGF2, IGF1 и Y27632, с SHH.

На DD10 смените носитель на KSR-N2, содержащий SHH. Промойте клетки один раз PBS без кальция и магния и добавьте в клетки предварительно подогретый, не содержащий трипсин реагент для диссоциации клеток, содержащий ДНКазу. Поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 10-30 минут или до тех пор, пока клетки не отделятся.

Затем осторожно постукивайте по тарелкам каждые пять минут, чтобы способствовать диссоциации. На DD5 смените носитель на KSR-N2, содержащий FGF2 и IGF1. Далее подготовьте планшеты для культивирования тканей для повторного покрытия на DD8.

На DD7 смените носитель на KSR-N2, содержащий FGF2 и IGF1. На DD8 повторно наклейте клетки разглаженным агонистом и добавьте атипичный ингибитор PKC. На DD10 смените носитель на KSR-N2, содержащий aPKCi.

На DD11 отсоедините ячейки от пластин для FACS. Если элементы не были отсоединены для FACS на DD11, смените среду на DD12 на KSR-N2, содержащий aPKCi. На DD14 смените носитель на KSR-N2, содержащий aPKCi.

А на DD16 смените носитель на KSR-N2, содержащий aPKCi. Затем на DD17 соберите Nkx-2.1:mCherry положительные клетки. Здесь представлены репрезентативные изображения иммуноокрашивания для Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry и Lhx6:GFP из культуры дифференцировки на 12-й день.

Обратите внимание, что эти изображения являются перекрывающимися каналами из одного поля зрения. На этом графике показана количественная оценка среднего процента DAPI-положительных ядер, экспрессирующих Nkx2.1 на DD12 в культуре. И это репрезентативный график FACS, демонстрирующий четыре различные популяции клеток, которые могут быть выделены с помощью нашей линии mESC с двойным репортером.

Обратите внимание, что mCherry находится на оси x, а GFP — на оси y. Таким образом, в верхнем правом поле представлены клетки, которые являются двойным положительным mCherry-GFP. Вот временной ход индукции Nkx2.1:mCherry и Lhx6:GFP от DD6 до 16, выраженный в процентах клеток в культуре, которые экспрессируют только mCherry, только GFP или коэкспрессируют mCherry-GFP.

После освоения этот протокол может быть завершен в течение 17 дней от начала до конца, если он выполнен правильно. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что всегда следует начинать с плевризонтных, недифференцированных, здоровых стволовых клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как трансплантация в неонатальный или взрослый неокортекс мыши, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся определения судьбы интернейронов или влияния трансплантации интернейронов на функцию цепи и поведение животных.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии развития к изучению факторов, определяющих судьбу межнейронов у мышей и, соответственно, у пациентов, страдающих от расстройств, связанных с интернейронами. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить экспрессирующие Nkx2.1 предшественники и их постмитотическое потомство из эмбриональных стволовых клеток мыши. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.