Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей
20 августа 2013 г.
Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.
Общая цель данной процедуры заключается в отслеживании отдельных гаплоидных клеток дрожжей на протяжении всего их репликативного жизненного цикла. Первым этапом является изготовление микрофлюидного чипа, содержащего массив микроплато. Затем дрожжевые клетки загружаются в микрофлюидный чип, и поскольку область под микроплато имеет высоту, близкую к диаметру дрожжевой клетки, клетки оседают в этой области.
Затем поверх захваченных клеток дрожжей подается непрерывный поток свежей среды, и появляющиеся дочерние клетки вымываются этим потоком. Для визуализации изменений морфологии клеток или органелл, экспрессии и локализации белков, которые могут произойти в стареющих клетках дрожжей, используются светлопольная и флуоресцентная микроскопия. Основным преимуществом этого метода перед классическим методом микродиссекции является меньшая трудоемкость, а также возможность длительного непрерывного получения микроскопических изображений на протяжении всего жизненного цикла отдельных клеток дрожжей.
Хотя этот метод позволяет получить представление о репликативном старении, его также можно использовать в исследованиях, требующих непрерывного микроскопического наблюдения в течение длительного времени. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку на определенных этапах изготовления микрофлюидного чипа требуется особая осторожность. Кроме того, загрузка клеток в микрофлюидный чип может потребовать определенного опыта.
Форма из кремниевой пластины изготавливается методом мягкой литографии. Подробную информацию о ее производстве см. в прилагаемом протоколе. Вырежьте из плотной метки тонкие полоски размером примерно 0,5 мм на 3 мм.
С помощью скальпеля осторожно поместите полоски на кремниевую пластину-форму, слегка сверху над структурой канала между входными каналами и микро-padre. Затем накройте стеклянную чашку Петри двойным слоем алюминиевой фольги и поместите пластину в чашку. Алюминиевая фольга предотвратит вытекание PDMS между пластиной и чашкой Петри в процессе изготовления микрофлюидных чипов.
Для начала процедуры изготовления микрофлюидных чипов поместите пустой пластиковый стакан на весы и обнулите их. Налейте в пластиковый стакан 40 грамм основы PDMS. Добавьте отвердитель PDMS в массовом соотношении 1:10, что в данном случае составляет примерно четыре миллилитра.
Тщательно перемешивайте смесь одноразовой пластиковой пипеткой в течение нескольких минут; это важно для обеспечения правильной последующей полимеризации PDMS. Вылейте PDMS на подложку в стеклянной чашке Петри. Смесь PDMS в чашке Петри будет содержать большое количество пузырьков, которые необходимо удалить путем дегазации.
Поместите чашку Петри с PDMS в эксикатор, подключенный к вакуумному насосу, примерно на 30 минут, пока не будут удалены все пузырьки воздуха. Полимеризуйте PDMS, поместив чашку Петри с подложкой на нагревательную плитку при температуре 120 °C на один час, а затем при 65 °C еще на один час. По истечении двух часов из стеклянной чашки Петри извлеките подложку из алюминиевой фольги и полимеризованный PDMS.
Отделите алюминиевую фольгу от PDMS с обратной стороны пластины. Затем аккуратно поднимите слой PDMS с верхней части пластины. Положите слой PDMS на рабочий стол перевернутым образом, чтобы каналы были направлены вверх, и осторожно вырежьте скальпелем отдельные чипы, отпечатанные на PDMS.
Постарайтесь оставить около трех миллиметров PDMS по краям каналов. Следующий шаг — проделать отверстия в PDMS на концах входного, выходного и боковых каналов, как показано на данной схеме. Чтобы проделать отверстие, проденьте задумку люра 20-го калибра насквозь через PDMS строго перпендикулярно поверхности.
Удалите столбик PDMS в основании приманки перед тем, как вытянуть основание. Это снова необходимо, чтобы столбик PDMS не заблокировал только что пробитое отверстие. После того как все отверстия будут пробиты, очистите поверхности чипа от частиц пыли и остатков PDMS, приложив к ним скотч и сразу же удалив его.
Аналогичным образом очистите покровное стекло, к которому будет прикреплен чип. Поместите чип и покровное стекло под УФ-лампу настольного УФ-озонатора сторонами, которые необходимо соединить, лицом к лампе; подвергайте воздействию УФ-излучения в течение шести-восьми минут, после чего наложите облученные поверхности друг на друга. Осторожно постучите по боковым сторонам чипа, чтобы способствовать прикреплению PDMS к покровному стеклу и удалить возможные пузырьки воздуха.
Не нажимайте на верхнюю часть структуры канала, так как это может привести к прилипанию микроконтактов к крышке. То же самое касается и стекла. Поместите созданную микрофлюидную установку на нагревательную платформу при 100 °C на один час.
После этого проверьте качество прикрепления покровного стекла к чипу из PDMS, слегка приподняв края чипа. Если это невозможно, значит, соединение прошло успешно и чип готов к использованию. Чтобы подготовить микрофлюидный чип к загрузке клеток, поместите его в металлический держатель, проложив силиконовый гель между стеклом чипа и металлическими частями держателя.
Для создания водонепроницаемого уплотнения аккуратно закрутите гайки, чтобы не разбить стекло. Подсоедините тонкие трубки к боковому и выходному каналам чипа. Использование пинцета облегчает вставку трубок в пробитые отверстия.
Наполните шприц с Luer-Lock объемом 50 мл культуральной средой. Удалите воздух из шприца и последовательно подсоедините к нему шприц. Профильтруйте через иглу 20G, короткую толстую трубку и тонкую трубку.
Поместите шприц в шприцевой насос и запустите насос на высокой скорости до полного заполнения тонкой трубки средой. Вставьте тонкую трубку, соединенную со шприцем, во входной канал и позвольте среде протекать через чип со скоростью 10 microliters per minute. Соберите среду, выходящую из чипа, в чашку Петри.
Среда будет вытекать через боковой канал из-за разности сопротивления между боковым каналом, выполненным из плотного тега, и выходным каналом. Поместите чип на предметный столик микроскопа и настройте фокус микроскопа на контактных площадках.
Для начала данной процедуры подсоедините шприц с коническим наконечником объемом 5 мл к переходнику 20G и толстой трубке. Заполните шприц примерно 1 мл суспензии клеток, которую необходимо ввести в чип. Рекомендуемая концентрация клеток при загрузке составляет от 1 до 5 × 10⁶ клеток на мл.
Снизьте скорость потока шприцевого насоса до 0.5 microliters per minute. Самым сложным этапом данной процедуры является загрузка клеток в микрофлюидный чип. Обычно это требует определенной практики.
Подсоедините шприц с суспензией клеток к трубке выходного канала. Введите клетки, нажимая на plunger шприца. Осторожно наблюдайте через окуляр или на экране компьютера за тем, как клетки поступают в канал и оседают под микропластинами.
Продолжайте нажимать на поршень до тех пор, пока под прокладками не осядет достаточное количество клеток. Оптимальная нагрузка составляет от одной до трех клеток на прокладку. Отсоедините шприц, использованный для загрузки клеток, и промывайте боковой канал в течение нескольких минут при более высокой скорости потока, чтобы удалить пузырьки воздуха и/или клетки, которые еще не вышли из чипа.
Снова снизьте скорость потока шприцевого насоса до 0,5 microliters per minute и перекройте боковой канал, соединив его с толстой трубкой, на конце которой находится катетерная пробка. Увеличьте скорость потока шприцевого насоса до конечного значения от one to five microliters per minute. Скорость потока может варьироваться в зависимости от среды и штамма дрожжей.
Начните запись видео, установив микроскоп и камеру в соответствии с целью эксперимента. Ниже представлен пример таймлапс-видео роста одной клетки дикого типа E на среде YPD. Снимки среды делались каждые 10 минут; масштабная линейка соответствует пяти микрометрам.
Клетка вырабатывает в общей сложности 30 почек до своей гибели. Репликативную продолжительность жизни можно определить, подсчитав количество почек, образованных одной материнской клеткой. Эти данные преобразуются в кривую продолжительности жизни путем построения графика зависимости процента жизнеспособных клеток от количества образованных почек или числа поколений.
На этом рисунке представлен пример кривых продолжительности жизни, полученных для дикого типа штамма дрожжей и двух мутантных штаммов. Делеция гена SER2 приводит к сокращению продолжительности жизни, в то время как делеция гена FOB1 приводит к ее увеличению. Морфологию митохондрий в зависимости от возраста можно изучать с помощью микрофлюидного устройства.
Эксперимент по изучению старения проводили с использованием дрожжевых клеток дикого типа BY 7 42, экспрессирующих ILV 3G FP, который локализуется в митохондриях. На данном рисунке белая стрелка указывает на репрезентативный пример возрастных изменений морфологии митохондрий в отдельной клетке. Все изображения имеют одинаковый масштаб; масштабный отрезок соответствует пяти микрометрам.
На втором ускоренном видео запечатлена одна клетка, экспрессирующая ILV 3G FP, из эксперимента по наблюдению за морфологией митохондрий в зависимости от возраста. Снимки делались каждые 30 минут; масштабная линейка соответствует пяти микрометрам. На этом заключительном рисунке показана морфология митохондрий, наблюдаемая в одном и том же наборе клеток на разных этапах репликативного старения: перед образованием первой почки, после 10 почек и перед гибелью.
Приведены примеры изображений для каждого класса морфологии: трубчатой, фрагментированной трубчатой, а также пятен и крупных пятен. Изменения морфологии, наблюдаемые в клетках среднего возраста, напоминают те, что были описаны ранее при непрерывном мониторинге клеток в процессе их деления. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы о репликативном старении дрожжей, такие как: почему стареет клетка дрожжей, какие фенотипические изменения происходят и как они влияют на репликативный срок жизни дрожжей?
После просмотра этого видео вы должны узнать, как создавать собственные микрочипы и изучать репликативное старение клеток, используя практически любой флуоресцентный микроскоп.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается микрофлюидное устройство, предназначенное для непрерывного получения изображений одиночных почкующихся клеток дрожжей с высоким разрешением на протяжении всего их репликативного жизненного цикла. Этот метод позволяет наблюдать за клеточными изменениями с течением времени, что дает возможность изучить процессы старения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микрофлюидика
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Отслеживание отдельных гаплоидных клеток дрожжей на протяжении всего их жизненного цикла имеет решающее значение для понимания клеточного старения.
- Традиционные методы, такие как микродиссекция, трудозатратны и менее эффективны для долгосрочных исследований.
- Микрофлюидные технологии представляют собой более эффективную альтернативу для непрерывного наблюдения.
- Световая и флуоресцентная микроскопия позволяют выявить важные изменения морфологии и экспрессии белков.
Цель исследования
- Разработать метод отслеживания одиночных клеток дрожжей на протяжении всего их жизненного цикла.
- Визуализировать изменения морфологии клеток и локализации белков в процессе старения.
- Усовершенствовать классические методы, предложив менее трудоемкий подход.
Используемые методы
- Создание микрофлюидного чипа с массивом микролунок.
- Загрузка клеток дрожжей в микрофлюидный чип.
- Подача непрерывного потока свежей среды для поддержания жизнеспособности клеток.
- Использование микроскопии для мониторинга клеточных изменений с течением времени.
Основные результаты
- Успешное отслеживание отдельных клеток дрожжей на протяжении всего их репликативного жизненного цикла.
- Наблюдение за изменениями морфологии клеток и органелл.
- Документирование вариаций экспрессии и локализации белков в стареющих клетках.
- Демонстрация преимуществ микрофлюидных методов по сравнению с традиционными подходами.
Выводы
- Микрофлюидное устройство позволяет получать изображения клеток дрожжей с высоким разрешением.
- Данный метод дает ценную информацию о процессе старения клеток.
- Это представляет собой значительный прогресс в изучении клеточной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Непрерывное микроскопическое наблюдение высокого разрешения за репликативным старением почкующихся дрожжей позволяет осуществлять точный лонгитюдный мониторинг фенотипов отдельных клеток в заданных условиях. Эта микрофлюидная платформа обеспечивает надежную проверку гипотез о механизмах клеточного старения, повышая прогностическую уверенность в процессах раннего поиска и валидации мишеней. Данный подход оптимизирует принятие решений по портфелю исследований, предоставляя воспроизводимые количественные данные о динамике клеток и органелл на протяжении всего периода репликативного старения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверять гипотезы, связанные со старением, на уровне отдельных клеток.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем визуализации локализации белков и морфологических изменений с течением времени.
- Способствует функциональной валидации мишеней посредством непрерывного количественного наблюдения за фенотипическими результатами.
- Предоставляет высококонтентные данные для создания прогностических моделей и приоритизации портфеля исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем с живыми клетками для последующего скрининга модуляторов, влияющих на репликативный срок жизни.
- Получение стандартизированных, воспроизводимых результатов визуализации, подходящих для разработки количественного анализа.
- Возможность масштабируемого автоматизированного мониторинга до 50 отдельных клеток в одном эксперименте.
- Обеспечение надежной оценки влияния соединений на фенотипы клеточного старения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, в которых ключевым механизмом является клеточное старение или сенесцентность.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет возможности лонгитюдного мониторинга биомаркеров.
- Снижает трансляционный риск путем создания количественных наборов данных, имеющих четкое механистическое обоснование.
- Поддерживает принятие взвешенных решений по развитию терапевтических программ, направленных на борьбу со старением, с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод микрофлюидного имиджинга интегрируется в непрерывный процесс исследований — от раннего тестирования гипотез до идентификации перспективных соединений и доклинической валидации, где критически важны разрешение на уровне отдельных клеток и лонгитюдные данные.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проведение исследований репликативного старения на основе гипотез и выяснение соответствующих путей.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу воспроизводимые системы для оценки воздействия вмешательств на фенотипы старения.
- Аналитика: позволяет строить количественные кривые продолжительности жизни и получать морфологические показатели для достоверного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: обеспечивают согласованность с биомаркерами старения и механистическими конечными точками, актуальными для моделей заболеваний.
- Повторное использование в организации: предлагает универсальную платформу, адаптируемую к различным типам клеток и экспериментальным вопросам в исследованиях старения.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность в исследованиях старения.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и автоматизированные рабочие процессы для непрерывного мониторинга клеток.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности продолжения разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления воспроизводимых данных с высоким содержанием информации.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней и программ, связанных со старением, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в изготовлении микрофлюидных чипов и визуализации живых клеток.
- Необходим доступ к инфраструктуре флуоресцентной и светлопольной микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов производства чипов и анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для других модельных систем при соответствующей оптимизации размеров чипа и параметров потока.
- Этапы загрузки и манипуляций могут потребовать предварительной отработки для обеспечения воспроизводимости и минимизации технической вариабельности.
