Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей

Общая цель этой процедуры заключается в отслеживании отдельных гаплодрожжевых клеток в течение всего их репликативного жизненного цикла. Первым шагом является создание микрофлюидного чипа, содержащего массив микропрокладок. Затем дрожжевые клетки загружаются в микрофлюидный чип, и, поскольку область под микропрокладками имеет высоту, аналогичную диаметру дрожжевой клетки, клетки поселятся там.

Затем на захваченные дрожжевые клетки подается непрерывный поток свежей среды, а возникающие дочерние клетки размываются потоком светлого поля и флуоресценции среднего размера. Микроскопия используется для визуализации изменений в морфологии клеток или органелл, экспрессии белка и локализации белка, которые могут произойти в стареющих дрожжевых клетках. Основное преимущество этого метода перед классическим методом микродиссекции заключается в том, что он менее трудоемкий и позволяет получать долгосрочные непрерывные микроскопические изображения всего жизненного цикла отдельных дрожжевых клеток.

Хотя этот метод может дать представление о репликативном старении, он также может быть использован для исследований, требующих непрерывного микроскопического наблюдения в течение длительных периодов времени. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что необходимо соблюдать осторожность на определенных этапах производства микрочипа. Кроме того, загрузка ячеек в микрочип может потребовать некоторого опыта.

Форма для кремниевых пластин изготавливается методом мягкой литографии. Для получения подробной информации о его производстве обратитесь к сопроводительному протоколу. Текст нарезаем кусок жесткой бирки на тонкие полоски примерно 0,5 миллиметра на три миллиметра.

С помощью скальпеля осторожно поместите полоски на форму для силиконовых пластин немного поверх структуры канала между входными каналами и микропадре. Далее накройте стеклянную чашку Петри двойным слоем алюминиевой фольги и положите в чашку Петри. Алюминиевая фольга предотвратит попадание PDMS между пластиной и чашкой Петри во время производства микрофлюидных чипов.

Чтобы начать процедуру изготовления микрофлюидных чипсов, поставьте на весы пустой пластиковый стаканчик и разорвите весы. Насыпьте в пластиковый стаканчик 40 грамм основы PDMS. Добавьте отвердитель PDMS в соотношении массы к весу один к 10, что в данном случае составляет около четырех миллилитров.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки тщательно перемешанной в течение нескольких минут, важно, чтобы смесь была хорошо перемешана, чтобы в дальнейшем обеспечить надлежащую полимеризацию PDMS. Вылейте PDMS поверх в стеклянную чашку Петри. Смесь PDMS в чашке Петри будет содержать много пузырьков для Дега.

Поместите PDMS, чашку Петри в влагопоглотительную жидкость, подключенную к вакуумному насосу, примерно на 30 минут, когда все пузырьки будут удалены. Полимеризуйте PDMS, поместив чашку Петри с вафлей на верхнюю часть горячей плиты при температуре 120 градусов Цельсия на один час, а затем при температуре 65 градусов Цельсия еще на один час. По истечении двух часов извлеките алюминиевую фольгу и полимеризованные PDMS из стеклянной чашки Петри.

Снимите алюминиевую фольгу с PDMS с обратной стороны пластины. Затем осторожно снимите слой PDMS с верхней части пластины. Поместите слой PDMS вверх ногами каналами на стол и аккуратно вырежьте скальпелем рисунки с одним чипом, отпечатанные на PDMS.

Старайтесь удерживать около трех миллиметров PDMS по краям каналов. Следующим шагом является пробивание отверстий в PDMS на концах входного выпускного отверстия и бокового канала, как показано на этой схеме. Чтобы пробить отверстие, протолкните заглушку приманки 20-го калибра через PDMS по прямой линии.

Снимите столбик PDMS с огрызка приманки, прежде чем вытаскивать огрызок. Опять же, это предотвращает блокировку колонны PDMS только что пробитым отверстием. После того, как все отверстия будут пробиты, очистите поверхности чипа от частиц пыли и остатков PDMS, наложив на него скотч и сразу же сняв скотч.

Аналогичным образом очистите покровное стекло, к которому будет прикреплен чип. Поместите скол и крышное стекло под УФ-лампу настольного УФ-озонового очистителя сторонами, которые необходимо соединить, лицом к лампе, подверженной воздействию ультрафиолетового света в течение шести-восьми минут, и положите открытые поверхности друг на друга. Аккуратно постучите по боковым сторонам чипа, чтобы облегчить прикрепление PDMS к защитному стеклу и удалить пузырьки воздуха.

Не постукивайте по верхней части конструкции канала, так как это может привести к прикреплению микропрокладок к крышке. Стекло тоже. Поместите только что изготовленную микрофлюидную установку на горячую плиту при температуре 100 градусов Цельсия на один час.

После этого проверьте прилегание защитного стекла к микросхеме PDMS, слегка приподняв края микросхемы PDMS. Если это невозможно, склеивание прошло успешно и чип готов к использованию. Чтобы подготовить микрофлюидный чип к загрузке ячейки, поместите чип в металлический держатель с силиконовым гелем между стеклом чипа и металлическими частями держателя.

Чтобы создать водонепроницаемое уплотнение, аккуратно закручивайте гайки, чтобы не разбить стекло. Подсоедините тонкие трубки к боковому каналу и выходному каналу чипа. Использование пинцета облегчает вставку трубки в пробитые отверстия.

Наполните шприц с приманкой объемом 50 миллилитров питательной средой. Удалите воздух из шприца и подсоедините его последовательно к шприцу. Отфильтруйте огрызок приманки 20 калибра, короткую толстую трубку и тонкую трубку.

Поместите шприц в шприцевой насос и быстро перемотайте насос вперед, пока тонкая трубка полностью не заполнится средой. Протолкните тонкую трубку, соединенную со шприцем, во входной канал и дайте среде течь через чип со скоростью 10 микролитров в минуту. Соберите среду, оставив чип в чашке Петри.

Среда будет вытекать через боковой канал. Из-за сопротивления разница между большой жесткой меткой выполнена боковым каналом и выходным каналом. Поместите чип на предметный столик микроскопа и установите фокус микроскопа на контактные площадки.

Чтобы начать эту процедуру, подсоедините к пятимиллилитровому шприцу наконечник приманки к огрызку приманки 20 калибра и толстой трубке. Загрузите в шприц примерно один миллилитр клеточной суспензии, которая будет загружена в чип. Предпочтительное количество ячеек для загрузки составляет от одного до пяти умножить на 10 из шести ячеек на миллилитр.

Уменьшите расход шприцевого насоса до 0,5 микролитра в минуту. Самой сложной частью этой процедуры является загрузка ячеек в микронный чип. Обычно это требует некоторой практики.

Подсоедините шприц, содержащий клеточную суспензию, к трубке выходного канала. Нагрузите ячейки, надавливая на поршень шприца. Осторожно наблюдайте за клетками, входящими внутрь и оседающими под микроподушечками, через окуляр или экран компьютера.

Поддерживайте давление на поршень до тех пор, пока под прокладками не осядет достаточное количество ячеек. Оптимальная нагрузка – от одного до трех ячеек на колодку. Отсоедините шприц, используемый для загрузки ячеек, и промойте боковой канал в течение нескольких минут при более высоких скоростях потока, чтобы удалить пузырьки воздуха и/или ячейки, которые еще не вышли из чипа.

Снова уменьшите расход шприцевого насоса до 0,5 микролитров в минуту и закройте боковой канал, подсоединив его к толстой трубке, на конце которой находится пробка катетера. Увеличьте расход шприцевого насоса до конечной скорости потока от одного до пяти микролитров в минуту. Скорость потока может варьироваться в зависимости от среды и штамма дрожжей.

Начните фильм с микроскопом и настройкой камеры, соответствующими цели эксперимента. Это пример покадрового фильма об одной дикой клетке типа Е, растущей на YPD. Средние изображения делались каждые 10 минут, а только что показанная масштабная линейка представляет собой пять микрометров.

Клетка производит в общей сложности 30 бутонов, прежде чем умереть. Репликативную продолжительность жизни можно определить, подсчитав количество почек, производимых одной материнской клеткой. Эти данные преобразуются в кривую продолжительности жизни путем построения графика процентного соотношения жизнеспособных клеток к количеству произведенных шишек или количеству поколений.

На этом рисунке показан пример кривых продолжительности жизни, полученных для штамма дрожжей дикого типа и двух мутантных штаммов. Делеция гена SER two приводит к сокращению продолжительности жизни, в то время как делеция гена FOB one приводит к увеличению продолжительности жизни. Морфология митохондрий в зависимости от возраста может быть изучена с помощью микрофлюидного устройства.

Эксперимент по старению был проведен с 7 42 дрожжевыми клетками дикого типа, экспрессирующими ILV 3G FP, который нацелен на митохондрии. На этом рисунке репрезентативный пример возрастных изменений в морфологии митохондрий в одной клетке обозначен белой стрелкой. Все изображения масштабируются одинаково, а масштабная линейка представляет собой пять микрометров.

Второй фильм с замедленной съемкой представляет собой одну клетку, экспрессирующую ILV 3G FP, из эксперимента, в котором наблюдалась морфология митохондрий в зависимости от возраста. Снимки делались каждые 30 минут, а масштабная линейка представляет собой пять микрометров. На этом последнем рисунке показана морфология митохондрий, наблюдаемая в одном и том же наборе клеток в разном возрасте репликации до образования первого бутона после 10 почек и до смерти.

Пример изображения каждого класса морфологии включает трубчатые, фрагментированные трубчатые, а также пятна и большие пятна. Морфологические изменения, наблюдаемые в клетках среднего возраста, напоминают те, о которых сообщалось ранее: при постоянном мониторинге клеток по мере их деления. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы репликативного старения дрожжей, например, почему дрожжевые клетки стареют, какие фенотипические изменения происходят и как они влияют на репликативную продолжительность жизни дрожжей?

После просмотра этого видео вы должны знать, как создавать собственные микрочипы и изучать репликативное старение в клетках с помощью практически любого флуоресцентного микроскопа.