Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Общая цель этой процедуры заключается в выделении подмножеств предшественников В-клеток из пуповинной крови. Это достигается путем выделения мононуклеарных клеток из пуповинной крови с помощью центрифугирования с градиентом плотности. На втором этапе антигены клеточной поверхности мечаются конъюгированными с биотином антителами для магнитного истощения любых оставшихся не-В-клеток.

Затем выделенные В-клетки флуоресцентно мечаются антителами против поверхностных антигенов клеток CD 19, CD 34 и CD 45. На заключительном этапе клетки сортируются с помощью проточной цитометрии для восстановления подмножеств предшественников В-клеток. В конечном счете, клетки достаточного количества и качества могут быть получены для использования в последующих анализах, требующих высокого качества ДНК и РНК.

Одно из преимуществ стратегии сортировки клеток перед альтернативными методами заключается в том, что наша стратегия требует меньше времени на проточный цитометр и всего три флуоресцентных антитела, что значительно снижает стоимость эксперимента. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с разнообразием доступных методов подготовки клеток пуповинной крови для проточной цитометрии и сложностью подготовки проточного цитометра. Хотя этот метод может дать представление о здоровых В-клетках-предшественниках, он также может быть применен к другим типам клеток, присутствующим в пуповинной крови, таким как Т-клетки, или к исследованиям заболеваний, связанных с любыми кроветворными клетками, таких как лейкемия или лимфома.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку трудно описать надлежащие методы, необходимые для обработки пуповинной крови и клеток таким образом, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток и уменьшить присутствие загрязняющего мусора. Чтобы выделить мононуклеарные клетки из пуповинной крови, сначала разведите восемь миллилитров аликвот пуповинной крови с 24 миллилитрами DPBS. Затем медленно выложите каждую разведенную смесь крови поверх 15 миллилитровых ватт фипа плюс в 50-миллилитровые конические пробирки, следя за тем, чтобы слои были разделены.

Затем центрифугируйте кровь в течение 40 минут при температуре 400 G и 20 градусов Цельсия, в то время как клетки разделяются с помощью метки градиента плотности семи пяти миллилитровых пробирок с круглым дном с указанием даты идентификации образца и любой другой соответствующей информацией, как указано в таблице. После разделения мононуклеарные клетки останутся на границе раздела плазмы fi opaque plus, в то время как гранулоциты и эритроциты будут осаждаться, теперь аспирируя верхние слои плазмы, избегая контакта со слоями мононуклеарных клеток. Затем с помощью стеклянной пипетки объемом 10 миллилитров аккуратно соберите слои мононуклеарных ячеек из трех 50-миллилитровых пробирок в одну новую 50-миллилитровую трубку.

Наполните эту новую пробирку PBS, аккуратно перемешайте клеточную суспензию, а затем промойте клетки два раза в течение 10 минут при температуре 300 G и 20 градусов Цельсия. После первой промывки суспензируйте гранулы и переложите в одну коническую трубку объемом 50 миллилитров. После второй промывки аккуратно восстановите суспензию клеточной суспензии в 200 микролитрах PBS, переведите один микролитр клеточной суспензии в один миллилитр PBS в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра для подсчета.

Затем промойте клетки в 50-миллилитровой пробирке большим количеством PBS, после чего полностью удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Чтобы изолировать В-клетки от мононуклеарных клеток, сначала Резус суспендирует только что промытую гранулу в 160 микролитрах четырех градусов Цельсия. Свежеприготовленный буфер DGA E-D-T-A-P-B-S.

Затем смешайте 40 микролитров набора для выделения В-клеток, биококтейль антител ITIN с клеточной суспензией. После инкубации клеток в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия смойте свободные антитела в одном миллилитре четырех градусов Цельсия, буфер E-D-T-A-P-B-S на 10 миллионов клеток. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 320 микролитрах четырех градусов Цельсия E-D-T-A-P-B-S буфере.

Теперь смешайте 80 микролитров микрогранул антибиотина с клеточной суспензией после 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия. Еще раз промойте ячейки, пока они вращаются. Поместите колонку LS в магнитное поле максимального сепаратора и капните через колонку три миллилитра четырех градусов Цельсия E-D-T-A-P-B-S.

Далее ресуспендируют до 100 миллионов отмытых клеток в 500 микролитрах четырех градусов Цельсия, E-D-T-A-P-B-S буфере. Затем пипеткой клеточную суспензию наносят на колонку, собирая немеченые клетки, которые проходят через колонку, в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте еще два миллилитра четырех градусов Цельсия, буфер E-D-T-A-P-B-S к стенкам исходной конической трубки, по одному миллилитру за раз, а затем осторожно перемешайте и нанесите остаточную клеточную суспензию на колонку каждый раз, чтобы убедиться, что все клетки будут восстановлены.

Наконец, заполните коническую трубку, содержащую немеченые клетки, PBS. После центрифугирования клетки аккуратно удаляют надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Затем аккуратно суспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера E-D-T-A-P-B-S.

Начните мечение антител. Для начала перенесите один микролитр клеточной суспензии в ранее помеченную неокрашенную пробирку. Добавьте в пробирку 500 микролитров буфера E-D-T-A-P-B-S и храните его на льду.

Выключите все лампы, а затем добавьте по 20 микролитров антител CD 19, CD 34 и CD 45 на 1 миллион клеток в оставшуюся клеточную суспензию. Хорошо перемешайте и поставьте тюбик в темноту на 30 минут при комнатной температуре. Затем перенесите 40 микролитров суспензии меченных антителами клеточной суспензии в пробирку, меченную семью А D и D пробиркой.

Промойте клетки в одном миллилитре PBS, а затем снова суспендируйте поддон в 100 микролитрах связующего буфера. Добавьте к этим клеткам семь микролитров семи A-d, а затем инкубируйте их в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре, пока клетки мечаются семью A-d, долейте пробирку клеток, меченных антителами, с помощью PBS, промойте клетки, меченные антителами, а затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера E-D-T-A-P-B-S. Теперь перенесите весь объем суспензии меченых антителом клеток в пробирку с CD 19 положительным CD 34 положительным CD 45 положительным мечением.

Промойте пробирку дополнительным одним миллилитром буфера E-D-T-A-P-B-S и перенесите остаточную клеточную суспензию в пробирку с положительной меченой CD 19 CD 34 положительной CD 45. Наконец, добавьте 300 микролитров связывающего буфера в семь пробирок A D для сортировки клеток с помощью проточного цитометра MO flow XDP. Сначала настройте поток MO для сортировки, запустите соответствующие элементы управления компенсацией, а затем создайте протокол, включающий графики, как показано на этом рисунке.

Убедитесь, что система откачки аэрозоля работает все время, а затем используйте неокрашенный образец для установки напряжения и коэффициента усиления для прямых и боковых диаграмм рассеяния. Выявить популяции с негативной флуоресценцией. Установите пороговое значение меньше или равно 1%, чтобы любой мусор, содержащий ДНК, не загрязнил восстановленные образцы.

Проведите около 50 000 событий CD 19 с положительным CD 34 положительным CD 45 положительным образцом. Чтобы установить стратегию стробирования, как показано только что было показано, перенесите обратное стробирование незаполненного CD 19 положительного CD 34 положительного слоя на диаграмму бокового рассеяния против прямого рассеивания. Чтобы убедиться, что лимфоцитарная походка включает в себя потенциальные про-В-клетки.

Используйте этот образец, чтобы также установить отрицательную популяцию флуоресценции для окрашивания семи а д. Затем запустите семь a a d выборки, чтобы определить жизнеспособность образца только из образца с жизнеспособностью более или равной 95% в начале, поскольку мертвые клетки будут окрашиваться без разбора и могут загрязнить сортировочные популяции, которые теперь настроены решения о сортировке для сбора популяций CD 19 положительный, CD 34 положительный CD 19 положительный, CD 34 положительный CD 19 положительный, CD 34 отрицательный, CD 19 положительный, CD 34 отрицательный, CD 45 средний и CD 19 положительный. CD 34 отрицательный CD 45 высокий.

Включите лимфатические и дуплетные дифференцирующие гейты в типовые решения всех популяций для предотвращения закупорки. В наконечнике для сортировки отфильтруйте положительный образец CD 19 и положительный CD 34 положительный CD 45 через сетчатый фильтр размером 40 микрон непосредственно перед сортировкой. Затем поместите помеченные пробирки для сбора, покрытые 2%-ным FBS, в PBS в держатель для пробирок со льдом и отсортируйте ячейки в соответствующую пробирку сразу после завершения сортировки.

Извлечение ДНК между вариациями образцов играет роль в успехе клетки, сортировка в хорошем сорте. В лимфоцитарной походке наблюдается высокий процент клеток. Образцы с хорошими показателями успеха содержат низкие уровни загрязняющего мусора, о чем свидетельствует низкое количество событий, которые попадают ниже и левее от популяции гейтированных лимфоцитов.

Образцы с низкими показателями успеха содержат большое количество загрязняющего мусора. Скудные выборки показывают заметное увеличение числа этих событий. Отсортированные в потоке клетки и последующая ДНК, выделенная из каждого подмножества В-клеток-предшественников, имеют количество и качество для проведения последующих анализов.

Мы обычно использовали эту ДНК в Myra для обогащения из метилированной ДНК вот ДНК, выделенной из CD 19 положительной CD 34 положительных клеток CD 19 положительных, CD 34 отрицательных CD 45 низких клеток CD 19 положительных, CD 34 отрицательных CD 45 средних клеток и CD 19 положительных CD 34. Отрицательные клетки с высоким уровнем CD 45 обрабатывали ультразвуком на высоком уровне в течение девяти минут, очищали колонку, а затем визуализировали на геле 1% aros с окрашиванием гелем кибер-зеленого нуклеинового кислот в этой полосе. Контрольная лестница из 100 пар оснований также проводилась после Майры с использованием метода активного мотива коллектора ультра ПЦР с контролем метилированных генов SLC 25 A 37 и контрольных неметилированных генов APC one для подтверждения обогащения метилированной ДНК.

Более высокое усиление SLC 25. A 37 подтверждает обогащение метилированной ДНК в субпопуляциях предшественников B-клеток После освоения этого метода его можно выполнить за 10 часов, если он выполнен правильно. При проведении этой процедуры важно помнить о том, что нужно обращаться с клеткой очень бережно и использовать оптимальное количество антител, чтобы образование загрязняющего мусора было сведено к минимуму.

Другие методы, такие как секвенирование нового поколения, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены метилированы и подмножества предшественников В-клеток. Не забывайте, что работа с живыми человеческими клетками может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры следует всегда принимать меры предосторожности, такие как запуск системы аэрозольной эвакуации.