Чувствительностью и специфичностью Количественный метод определения Сыворотка Сердечная Миозина связывающий белок-C по электрохемилюминесценцию иммуноферментного

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном количественном определении сердечного миозинсвязывающего белка С и сердечного тропонина I в образцах сыворотки. Это достигается путем предварительного покрытия 96-луночного планшета сердечным антителом к миозинсвязывающему белку С для плексного анализа или с использованием предварительно закодированного триплексного анализа. На втором этапе планшеты с покрытием инкубируются с калибраторами и образцами сыворотки.

Затем добавляются меченые антитела для обнаружения на последнем этапе, генерируется хемилюминесцентный сигнал, который обнаруживается считывателем планшетов. В конечном счете, уровни сердечных белков, представляющих интерес, присутствующих в образцах сыворотки, могут быть определены с помощью одиночного или мультиплексного иммуноанализа. За день до эксперимента внесите пипеткой 30 микролитров мышиного моноклонального антисердечного миозинсвязывающего белка С антител без желатина в нижний угол каждой лунки 96 лунок мисомасштаба для открытия голой стандартной пластины.

Затем постучите по боковым сторонам пластины, чтобы распределить раствор антитела по дну каждой лунки. После запечатывания инкубируйте планшет в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия без встряхивания. На следующее утро выложите раствор над раковиной, а затем на стопку бумажных полотенец.

Затем добавьте 150 микролитров 1%-го блокатора А в PBS в каждую лунку, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Инкубируйте запечатанную пластину в течение одного часа при комнатной температуре, встряхивая при 700 об/мин во время стадии блокирования, разбавьте рекомбинантный фрагмент сердечного миозинсвязывающего белка С до исходной концентрации 2000 нанограмм на миллилитр в 1%-ном блокаторе А в PBS. Затем последовательно разбавляют этот раствор в пять раз, что в сумме получается на семь стандартов.

Теперь удалите блокирующий раствор, как показано только что на рисунке, а затем трижды промойте пластину 150 микролитрами 0,05%tween 20 в PBS. После третьего мытья энергично переведите тарелку над раковиной, а затем плотно похлопайте тарелку по слою бумажных полотенец до полного высыхания. Далее пипеткой накапывают по 25 микролитров каждого стандарта и отбирают пробу в соответствующие лунки.

Затем, пока герметичная пластина инкубируется в шейкере в течение одного часа при комнатной температуре, разбавляют специально изготовленное сердечное антитело для обнаружения миозина, связывающего белок С, меченное sul oag, до одного микрограмма на миллилитр в 1% блокаторе А в PBS. После тщательной промывки планшета, как показано выше, добавьте 25 микролитров раствора антител для обнаружения в каждую лунку, а затем инкубируйте герметичную пластину в течение одного часа при комнатной температуре, встряхивая в течение инкубационного периода, запустите демонстрационную пластину со светодиодными индикаторами, чтобы убедиться в правильной работе секторного тепловизора, и программное обеспечение разбавьте буфер Рейда в это время. После тщательной промывки планшета, как показано ранее, с помощью многоканальной пипетки добавьте 150 микролитров буфера Рейда в каждую лунку, стараясь избежать образования пузырьков воздуха, а затем немедленно отсканируйте планшет в секторном тепловизоре перед началом трехплексного анализа.

Дайте 96-луночному триплексному планшету и растворам разбавителя уравновеситься до комнатной температуры. Затем добавьте в тарелку 25 микролитров 1%-го блокатора А в PBS, убедившись, что вся лунка покрыта раствором, и инкубируйте герметичную пластину при комнатной температуре в течение 30 минут, встряхивая. В то же время, разбавляя рекомбинантный сердечный миозинсвязывающий белок C-C-K-M-B и сердечный тропонин I вместе в 1% блокаторе А в PBS, чтобы создать стандарт, содержащий 2000 нанограммов на миллилитр сердечного миозинсвязывающего белка C, 100 нанограммов на миллилитр CKMB и 25 нанограммов на миллилитр сердечного тропонина.

Затем я последовательно разбавляю эту смесь в пять раз до конечного объема не менее 100 микролитров для каждого стандартного разбавленного образца два раза 1%-ным блокатором А в PBS. Затем добавьте 2 технических повтора стандартов по 25 микролитров, а также образцы к 25 микролитрам блокирующего буфера, уже присутствующего в лунках трехплексного планшета, включите заготовку разбавителя только после инкубации герметичной пластины во время встряхивания, разведите три антитела для обнаружения SUL oag вместе до конечной концентрации один микрограмм на миллилитр каждый в 1% растворе блокатора А и PBS через два часа. Вымойте пластину, как только что показано, а затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 25 микролитров раствора антител для обнаружения в каждую.

Хорошо инкубируйте герметичную пластину в течение одного часа, встряхивая при этом при 700 оборотах в минуту в течение инкубационного периода. Запустите демонстрационную пластину и разбавьте буфер Рейда, как показано только что на рисунке. Затем, промыв планшет с 0,05% до 20 в PBS, с помощью многоканальной пипетки добавьте 150 микролитров буфера Рейда в каждую лунку, избегая образования пузырьков воздуха, и немедленно отсканируйте пластину в секторном тепловизоре.

На этом рисунке стандартная кривая сердечного миозинсвязывающего белка С в плексном анализе сравнивается с кривой сердечного миозинсвязывающего белка С в трехплексном анализе. Оба анализа демонстрируют очень высокую чувствительность и широкий динамический диапазон. Область обнаружения анализа отображается серым цветом, как плекс, так и три.

Стандартные кривые сердечного миозин-связывающего белка С аналогичны. Нижний предел обнаружения, нижний предел количественного определения и верхний предел количественного определения сопоставимы как в плексном, так и в триплексном анализах. На этих графиках показаны стандартные кривые сердечного тропонина I и CKMB триплексной пластины.

Оба калибратора показали высокую чувствительность и большой динамический диапазон. Область обнаружения анализа отображается серым цветом. Перекрестная реактивность детектирующих антител с двумя другими калибраторами изучалась путем инкубации индивидуальных стандартных кривых всех трех калибраторов с антителами одиночного обнаружения; между калибратором CKMB и антителами для обнаружения сердечного тропонина I и сердечного миозинсвязывающего белка С наблюдалась лишь низкая перекрестная реактивность.

Несмотря на то, что не наблюдалось перекрестной реактивности между другими калибраторами и антителами для обнаружения в качестве доказательства применимости анализа для выявления повреждения сердца, уровни в сыворотке крови 16 пациентов с инфарктом миокарда сравнивали с контрольной группой с использованием трех уровней сердечного миозин-связывающего белка C-C-K-M-B и сердечного тропонина в сыворотке трех сложных планшетов. У пациентов с инфарктом миокарда было установлено, что все три биомаркера были повышены по сравнению с контрольной группой.