Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке основных физических характеристик клеточных образцов, включая массу и объем, с помощью стандартного оптического микроскопа и обработки изображений. Это достигается путем предварительного монтажа клеточных образцов, выращенных на стеклянных покровных стеклах, на предметные стекла микроскопа. Далее через фокус получаются светлопольные и дифференциальные интерференционно-контрастные изображения.

Затем каждый стек изображений Z вводится в отдельные программы обработки изображений MATLAB, которые извлекают физические данные. В конечном счете, основные физические свойства клеточных образцов получают с помощью измерений интенсивности фокусировки в условиях светлопольной контрастной и дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что клеточные образцы не нужно фиксировать, проникать или окрашивать.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, например, как субклеточная плотность организована во время клеточного цикла или среди различных клеточных популяций, способствующих заболеванию Использование микроскопа с возможностями DIC и brightfield и дополнительными спецификациями в соответствии с текстовым протоколом начните с открытия программного обеспечения для слайдбука и создания нового слайда для сбора изображений. Затем откройте окно фокусировки и в разделе набора фильтров выберите DIC На вкладке прицела под секцией конденсатора отрегулируйте ползунок диафрагмы в самое дальнее правое положение. Это обеспечивает высокую числовую апертуру и улучшает оптическое сечение образца.

После захвата стека DIC образца откройте окно фокусировки и выберите «Открыть». В разделе набора фильтров отрегулируйте ползунок диафрагмы в крайнее левое положение, закрытое до упора, чтобы обеспечить низкую освещенность NA. После регулировки интенсивности сигнала откройте окно захвата изображения.

Настройки 3D-съемки из стека DICZ будут отображаться в разделе набора фильтров окна захвата изображения. Поставьте галочку в открытом поле и укажите время выдержки. В разделе «Информация об изображении» присвойте ему имя и нажмите кнопку «Начать», чтобы начать получение изображения Zack.

Затем экспортируйте стеки Z в соответствии с текстовым протоколом для выполнения измерений объема один раз в программе H-T-D-I-C MATLAB под названием JoVE HT DCO V one M В нулевом разделе обновите переменную каталога зависимостей, скопировав и вставив директорию, содержащую гильберт. Преобразование DM и собеля edge Detect M файлов из проводника. Между одинарными кавычками, следующими за зависимостями, директория равна выполнению нулевого раздела программы joco HT DCO V one M.

В первом разделе обновите каталог изображений, скопировав и вставив каталог, содержащий изображения сквозного фокуса в форме dot TIF. Между одинарными кавычками запустите этот раздел только один раз для выравнивания и поворота изображений. Для выполнения преобразования Гильберта появится второй раздел кода Появится диалоговое окно под названием Определить параметры HT DIC.

Затем введите номер фокальной плоскости, в которой DIC-изображение образца находится в фокусе, боковое разрешение, осевое разрешение, угол поворота DIC-изображения, необходимый для выполнения преобразования Гильберта, и, наконец, размер интересующей области. Затем нажмите «ОК». Изображение фокальной плоскости DIC, заданной номером фокальной плоскости, появится в синем прямоугольнике.

Расположите рамку над интересующим объектом, например ячейкой. После того, как рамка будет расположена над нужной областью, дважды щелкните внутри B. Контраст изображения должен быть таким, чтобы темные черты отображались слева, а яркие — справа. Перетащите синюю рамку на область интереса и измените ее форму по мере необходимости.

Далее, в разделе три, чтобы создать прямоугольную маску, выполните строку комментария 1 6 7 и строку комментария 1 7 0 выполните третий раздел программы, щелкнув по изображению и перетащив мышь, чтобы начать определение прямоугольной маски. Затем дважды щелкните по окошку, чтобы принять его. Чтобы создать нарисованную от руки маску, прокомментируйте строку 1 6 7 и снимите строку комментария 1 7 0 перед выполнением раздела три Щелкнув и нарисовав нужную маску мышкой, дважды щелкните по маске, чтобы принять ее после выполнения четвертого раздела, чтобы создать преобразованные стеки изображений Гильберта в соответствии с текстовым протоколом выполняется раздел пятый.

Для оптимизации сегментации изображений поперечного сечения xz исследуемой области. На рисунке 500, созданном программой, отображаются три различных типа контраста. Успех алгоритма нахождения границ ячейки зависит от комбинации используемой маски и значения порога в строках 2, 2, 9 программы, начните со значения 0,5 и настройте значение порога и повторите этот раздел программы до тех пор, пока не будет достигнута правильная обводка в одном из столбцов.

Если структура лучше всего указана в первом столбце, то при сегментации DIC используйте шестой раздел для определения объема. Если второй столбец дал оптимальные результаты, запустите седьмой раздел для определения объема ячейки по Гильберту, преобразуйте изображения DIC ЕСЛИ третий столбец дал оптимальные результаты, используйте отфильтрованное преобразование Гильберта DIC для выполнения восьмого раздела для определения объема для измерения массы в программе NIQ PM MATLAB под названием JO VCO NI qpm V1 M Under section zero. Обновите расположение трех зависимостей каталогов, BRIGHTFIELD и DIC после запуска первого раздела, запустите второй раздел в диалоговом окне под названием определение параметров N-I-Q-P-M, введите номер фокальной плоскости, где в фокусе находится изображение яркого поля образца, боковое разрешение, осевое разрешение и размер интересующей области.

Затем нажмите «ОК». Изображение светлопольной фокальной плоскости, заданной номером фокальной плоскости, появится в виде синего прямоугольника. После корректировки фокуса, если это необходимо, повторив второй раздел, перетащите блок вокруг изображения, выберите узлы блока и перетащите его, чтобы изменить его размер, прежде чем дважды щелкнуть внутри блока, чтобы принять его.

После того, как стек изображений светлого поля был построен путем выполнения третьего раздела, выполните четвертый раздел для создания фазовой карты, псевдо ДИК изображений и сравнений с изображениями светлого поля, а также истинного ДИК-изображения, когда псевдо ДИК и истинные ДИК изображения максимально похожи, выполните пятый раздел А или 5 В, который позволяет пользователю очертить ячейку для создания карты плотности массы. Общая масса и гистограмма плотности клеток корректны. Освещение образца во время получения изображения через фокус имеет решающее значение для успешной реализации алгоритмов N-I-Q-P-M и H-T-D-I-C. На этом рисунке показана низкая и высокая освещенность NA как при DIC, так и при контрасте в светлом поле для полистирольной сферы и клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека SW six 20.

Эти панели демонстрируют оптимальную визуализацию для N-I-Q-P-M, а эти отображают оптимальную визуализацию для HT DIC. Эти изображения демонстрируют зависимость алгоритма NIQ PM от параметров, выделяя как успешные, так и неудачные реализации. В этой статье мы исследуем фазовый профиль полистирольной сферы диаметром 4,8 микрометра.

Ожидаемый профиль известен теоретически и, таким образом, может быть напрямую сравнен с реконструкцией NIQ PM. Эти панели обеспечивают наилучшую реконструкцию для дифракционных эффектов сферы как на границах сферы, так и внутри нее, предотвращая стабильную реконструкцию во всех точках сферы. Центральная область сферы может быть захвачена с помощью N-I-Q-P-M с процентной погрешностью от одного до 5%, как это видно в сотовых образцах панели L, фазовые свойства которых неизвестны.

Априори может быть реконструировано с помощью NIQ PMM в сочетании с процедурой сравнения псевдо-ДВС-изображения с реальным ДВС-изображением. N-I-Q-P-M имеет один свободный параметр. Плоскость в стеке изображений в правом поле, в которой центрируется расчет.

Эту центральную фокальную плоскость следует корректировать до тех пор, пока изображения псевдо DIC и истинного DIC не будут выглядеть максимально похожими. Здесь представлены изображение вне фокуса, находящееся вне фокуса, оптимальное изображение псевдо DIC и соответствующее изображение ячейки, полученное с коэффициентом освещенности 0,9. Интересно, что наилучшая фазовая карта и соответствующее псевдо-изображение DIC не обязательно соответствуют изображению яркого поля в фокусе, как показано на этих панелях.

Наконец, здесь показаны шаги, связанные с алгоритмом обработки изображений H-T-D-I-C от DIC через фокусное изображение при освещенности NA равной 0,9, преобразование Гильберта выполняется для удаления базового рельефа изображений DIC. Это приводит к некоторому размытию вдоль оптической оси, которое можно убрать с помощью фильтрации высоких частот. Эти окончательные изображения легко сегментируются для определения площади в каждой плоскости поперечного сечения образца, чтобы сделать вывод об общем объеме клеток.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о правильном освещении для светлопольной или дифференциально-контрастной визуализации после этой процедуры. Другие методы, такие как флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы с использованием колокализации силы пола с картами плотности образца.