Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать плоскости льда, связанные флуоресцентно мечеными белками-антифризами. Это достигается за счет выращивания одиночных кристаллов льда, с которыми могут связываться белки антифриза в качестве второго этапа. Каждый кристалл рассматривается через скрещенные поляризаторы, чтобы установить его сингулярность и ориентацию.

Затем кристалл льда устанавливается на холодный палец с регулируемой температурой и формируется в полусферу. Затем его погружают в раствор флуоресцентно меченых белков-антифризов, чтобы абсорбировать белок антифриза на специфических плоскостях связывания растущего полусферического тела. Результаты измерения льда получаются путем визуализации льда, связанного флуоресцентно меченным белком-антифризом, с использованием удельного света и фильтров в затемненном холодном помещении.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как травление льдом, заключается в том, что белки антифриза флуоресцентно помечены флуоресцентно Чтобы обеспечить немедленную визуализацию связанных с белками плоскостей льда, начните выращивание кристаллов, приготовив ванну с контролируемой температурой этиленгликоля при температуре минус 0,5 градуса Цельсия и найдя чистую металлическую кастрюлю, которая помещается в нее и может плавать на ней. Кристаллы формируются в формах. Используйте цилиндрические формы высотой три-четыре сантиметра, вырезанные из поливинилхлоридной трубы.

Каждая форма должна иметь выемку шириной один миллиметр и высотой два миллиметра с одной стороны. Нанесите легкую пленку вакуумной смазки на ту сторону кольца, с которой была вырезана насечка. Запечатайте эту смазанную маслом поверхность с насечкой на металлическую сковороду так, чтобы выемка была направлена в сторону от центра сковороды.

Следите за тем, чтобы не заполнять и не загораживать выемки смазкой. Подготовьте столько формочек, сколько поместится в кастрюлю. Далее добавьте отфильтрованный Дега и деионизированную воду в центр кастрюли за пределами форм.

Будьте осторожны, чтобы не занести пузыри. По мере того, как слой воды поднимается до пяти миллиметров, вода должна медленно поступать в формы через насечки. Когда закончите, поместите кастрюлю идеально ровно в этиленгликолевую ванну.

После того, как кастрюля и вода достигнут минус 0,5 градуса по Цельсию, добавьте небольшой кусочек льда в середину сковороды за пределами форм. Инкубируйте в течение ночи, чтобы образовался слой льда в течение следующих трех дней. Вернитесь в ванну, чтобы добавить воды в формочки.

Внесите в каждую форму по 13 миллилитров четырех градусов Цельсия, Дега и деионизированную воду. Один раз в сутки после добавления воды снижайте температуру этиленгликолевой ванны. К четвертому дню формочки должны быть полностью заполнены льдом.

Достаньте формочки и подготовьте чистую поверхность для льда. Снимите каждую формочку со сковороды и вытолкните кристалл льда. Поместите чистую поверхность с формочками в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов Цельсия на один час.

Перед обращением. Когда лед будет готов, отнесите его в морозильную камеру или холодильную камеру, чтобы определить, является ли он монокристаллом. Поместите лед между двумя скрещенными поляризаторами.

Если лед представляет собой монокристалл, не должно быть видно трещин или разрывов, а направление света внутри кристалла не должно меняться. Когда поляризатор остается на месте, определите ориентацию оси C, наблюдая за светом, проходящим при вращении льда. Чтобы определить ориентацию A AEs, плотно оберните лед алюминиевой фольгой.

Ориентируйте иглу перпендикулярно морской оси и проделайте небольшое отверстие в фольге и во льду. Далее поместите лед в вакуум 0,5 миллибар на 20 минут. Как только кристалл будет извлечен, раскройте его в холодильной камере.

Обратите внимание на шестиугольный трав на базальной плоскости. Буквы A AE проходят через вершины шестиконечной звезды. Этот кристалл будет разрезан пополам по линии, параллельной противоположным точкам на звезде.

Чтобы обнажить плоскость первичной призмы, надежно удерживайте кристалл на скамье. С помощью ножовки разрежьте хрусталь пополам. Соберите детали для крепления на холодный палец.

Кристалл льда нужно дополнительно подготовить к установке на холодный палец, найти два алюминиевых стержня с немного разными диаметрами, но сопоставимыми по размеру с холодным пальцем. Чередуйте использование стержней для расплавления полости в верхней части кристалла, остановитесь, когда появится полость, в которую может поместиться холодный палец. Охладите холодный палец до минус 0,5 градуса по Цельсию и поместите его в ледяную полость.

Удерживайте кристалл на месте до тех пор, пока он не примерзнет к металлу. Затем заполните полусферическую чашку, диаметр которой примерно в два раза больше диаметра кристалла льда, отфильтрованной деионизированной водой, охлажденной до четырех градусов Цельсия. Погрузите холодный связанный пальцем кристалл льда в чашку, удалите лишнюю воду так, чтобы верхняя часть кристалла льда была примерно на уровне жидкости и лед не соприкасался.

Стенки чашки накрывают утеплителем и понижают температуру до минус пяти градусов по Цельсию. Дайте льду сформировать полушарие в течение примерно часа. Приготовьтесь добавить флуоресцентный белок.

Когда полушарие готово. Выньте кристалл льда из чашки, удалите воду из чашки. Затем добавьте от 25 до 30 миллилитров предварительно охлажденного флуоресцентно меченного белкового раствора в нужной концентрации.

Сохраняя общий объем жидкости неизменным разрешением, погрузите кристалл льда в чашку. Снова. Убедитесь, что верхняя часть кристалла находится на уровне жидкости и не касается стенок чашки. Снизьте температуру холодного пальца до минус восьми градусов по Цельсию и дайте белковому раствору замерзнуть в кристалле в течение двух-трех часов.

Остановите рост льда, когда из белкового раствора образуется не менее пяти миллиметров льда. Все еще приложив холодный палец, выньте кристалл льда из чашки. Отсоедините холодный палец, нагрев охлаждающую жидкость до температуры чуть выше нуля градусов Цельсия.

Подождите, пока кристалл льда растает. Когда кристалл растает с холодного пальца, положите его плоской стороной вниз на чистую поверхность. Будьте осторожны и не прикасайтесь к новообразованному льду.

Храните кристалл при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 20 минут, прежде чем приступить к визуализации флуоресцентной работы в холодном помещении, которое может быть затемнено. Подготовьте лампы с фильтрами возбуждения для определенной длины волны для возбуждения флуоресцентной метки и фильтрами излучения камеры. Чтобы заблокировать неспецифический свет, положите лед плоской стороной вниз под лампы, затемните комнату и наблюдайте за узорами на освещенном льду.

Чтобы оценить плоскости льда, которые связаны белками антифриза, сравните традиционное изображение травления льда с соответствующим флуоресцентным анализом плоскости льда Аффинный анализ с использованием trixy показывают белки антифриза первого типа, продуцируемые зимней камбалой pseudo pectus Americana. Метод может быть использован для одновременного сравнения схем связывания льда различными белками антифриза. В этом случае белок-антифриз первого типа меченый Pacific Blue типа три и белок-антифриз первого типа меченый trixy.

Это результат визуализации только третьего типа N-F-E-A-F-P восьмерки, здесь на этом изображении визуализирован только белок антифриза первого типа. Они визуализируются вместе. Обратите внимание, что ось C одинакова для каждого изображения.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выращивать и ориентировать одиночные кристаллы льда и использовать флуоресцентный анализ аффинности ледяной равнины для оценки паттернов связывания ледяной равнины флуоресцентно меченных белков антифриза.