$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Начните с добавления агарозы E3 со средней и низкой температурой плавления и нагревания до полного растворения агарозы. Охладите агарозу до 37 градусов Цельсия и добавьте раствор трикаина. Затем обезболите эмбрионы, добавив трикаин в чашку Петри, содержащую эмбрионы в среде Е3. Перемешайте чашку Петри, чтобы собрать эмбрионы в середине.
С помощью пипетки для переноса наберите один эмбрион с минимальным количеством среды. Держите пипетку в вертикальном положении и подбрасывайте эмбрион, чтобы расположить его на кончике пипетки. Теперь поместите эмбрион в раствор агарозы, не добавляя лишнюю среду, которая разбавит агарозу и предотвратит гелеобразование. Аккуратно перемешайте зародыш внутри агарозы и перенесите раствор в лунку рентгенографической пластины с помощью пипетки.
Поместите планшет под микроскоп и с помощью наконечника пипетки расположите эмбрион в нужной ориентации. Как только агароза застынет, налейте на нее среду E3, содержащую трикаин, чтобы агар оставался гидратированным, и сфотографируйте эмбрион. В качестве примера протокола мы установим парабиотические эмбрионы данио-рерио для визуализации и анализа.
Чтобы получить изображения сросшихся эмбрионов, приготовьте агарозу с низкой температурой плавления 0,8%. Пока он еще горячий, разложите один миллилитр агарозы в 1,5-миллилитровые микропробирки, установленные в нагревательный блок при температуре 37 градусов Цельсия. Обезболите парабиотические эмбрионы, добавив 1 миллилитр 4 мг на миллилитр рН 7,0 трикаина к 25 мл среды Е3, содержащей эмбрионы. Аккуратно перекрутите блюдо, чтобы эмбрионы скапливались в середине.
Затем с помощью пластиковой пипетки для переноса с широким наконечником наберите эмбрионы в как можно меньшее количество жидкости. Затем переверните пипетку вертикально и аккуратно подпрыгивайте эмбрионы, чтобы они осели на самое дно пипетки. Затем переложите зародыши в 1 миллилитр аликвоты с низкой температурой плавления, слегка коснувшись кончика пипетки на поверхности агарозы. Утилизируйте лишнюю жидкость из пипетки и с помощью пипетки аккуратно перемешайте эмбрионы в агарозе.
Затем с помощью пипетки перенесите агарозу и зародыши в лунку со стеклянным дном шестилуночной пластины. Под стереомикроскопом используйте гелевый наконечник, закрепленный на конце иглы, чтобы расположить эмбрионы близко к покровному стеклу и в желаемой ориентации для визуализации. После того как агароза застыла и в лунки была добавлена среда с трикаином, для получения изображений используется инвертированный широкопольный эпифлуоресцентный лазерный сканирующий конфокальный или конфокальный микроскоп с вращающимся диском.
Для полного поля зрения эмбриона используйте 4-кратное субъективное. Используйте 20-кратный объектив для изображения определенной ткани. Обрабатывайте изображения в соответствии с текстовым протоколом.