Стабилизация Гепатоцеллюлярной Фенотип используя оптимизированные синтетические покрытия

Общая цель данной процедуры заключается в оптимизации покрытых полимером поверхностей для обеспечения долгосрочного стабильного культивирования человеческих гепатоцитов, полученных из стволовых клеток. Это достигается путем первоначального синтеза полиуретана 1 3 4 или PU 1 3 4. На втором этапе необходимо выбрать подходящий растворитель для растворения PU 1 34.

Затем оптимизируется процесс спин-коатинга PU 1 3 4 на стеклянном покровном стекле. Заключительным этапом является оптимизация процедуры стерилизации покровных стекол, покрытых полимером P 1 34. В конечном итоге для изучения влияния полимерного покрытия PU 1 34 на функцию гепатоцитов, полученных из стволовых клеток, используются сканирующая электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия и анализы метаболизма лекарственных средств.

Основное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как использование матриц в культуре для поддержания потенции стволовых клеток URI, имеющих гепатоциты, заключается в том, что эти синтетические материалы могут быть точно настроены для конкретных целей и масштабированы в соответствии со стандартами обеспечения качества. Кроме того, они демонстрируют стабильность от партии к партии. Значение этого метода распространяется на терапию заболеваний печени, поскольку он представляет собой пример того, как поверхность синтетического полимера может быть оптимизирована для сохранения фенотипа клеток.

Процедуру продемонстрирует доктор Джеффри Уолтон, постдок из моей лаборатории. Перед началом данной процедуры проведите термическую обработку мономеров 1,6-гександиол-диэтиленгликоля и неопентилгликоля при 40 °C в течение 48 часов в вакуумном шкафу для удаления остаточной влаги. Добавьте по 22 ммоль каждого мономера и 55 ммоль дипиколиновой кислоты в двухгорлую круглодонную колбу, соединенную с аппаратом Дина-Старка и оснащенную магнитным перемешивателем.

После этого поместите всю сборку в вакуум и осторожно нагрейте стеклянную посуду при 40 °C в течение шести часов, чтобы избежать поглощения влаги при добавлении химического вещества в колбу. Извлеките сборку из печи, продуйте систему азотом, затем с помощью шприца по каплям добавьте в колбу 0,0055 моль катализатора — диоксида титана (IV). Перемешивайте реакционную смесь при 180 °C в течение 24 часов, собирая остаточную воду в ловушке Дина-Старка.

Дайте продукту остыть до комнатной температуры. Затем смешайте 3.2 millimole (или один эквивалент) полиола P-H-N-G-A-G с 6.4 millimole (или двумя эквивалентами) 4,4'-метиленбис(фенилизоцианата) в 12 milliliters безводного ДМФА в двухгорлой круглодонной колбе, соединенной с аппаратом Дина-Старка и оснащенной магнитной мешалкой.

Перемешивайте реакционную смесь при 70 °C в атмосфере азота. Затем с помощью шприца по каплям добавьте катализатор диоксид титана до конечной концентрации 0,8%. Через один час добавьте один эквивалент удлинителя цепи 1,4-бутандиола для получения продукта сополимера. Повысьте температуру до 90 °C и выдержите в течение 24 часов в атмосфере азота.

После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры по каплям добавьте диэтиловый эфир до тех пор, пока не будет наблюдаться осаждение полиуретанового продукта. Перенесите реакционную смесь в центрифужную пробирку и центрифугируйте раствор при 5 300 ×g в течение пяти минут. После декантации супернатанта высушите его при комнатной температуре до полного испарения растворителя.

Затем отвесьте 200 milligrams PU 1 34 в стеклянный флакон. Разбавьте образец до конечной концентрации 2% в хлороформе, смеси хлороформа и толуола в соотношении один к одному, тетрагидрофуране или смеси тетрагидрофурана и хлорметана в соотношении один к одному. Интенсивно встряхивайте раствор в течение 20 минут при комнатной температуре на шейкере со скоростью 200 движений в минуту до достижения гомогенности раствора и полного отсутствия осадка.

По завершении поместите стеклянное покровное стекло размером примерно 15 мм квадрат на спин-котер. С помощью пипетки нанесите на покровное стекло 50 µL раствора PU от одного до четырех. Центрифугируйте каждое покровное стекло в течение семи секунд при 23 ×g. Затем высушите покровное стекло на воздухе при комнатной температуре в течение не менее 24 часов перед стерилизацией. После этого подвергните каждое покрытое полимером покровное стекло гамма-облучению, используя лабораторный облучатель для воздействия дозы 10 Gr в течение 12 минут.

В качестве альтернативы облучите каждое покровное стекло с полимерным покрытием УФ-лампой мощностью 30 Вт в течение 16 минут с каждой стороны. По завершении поместите покровное стекло с полимерным покрытием в подходящий планшет для культивирования тканей в соответствии с размером стекла. После культивирования и дифференцировки линии эмбриональных стволовых клеток человека отделите клетки с помощью реагента для диссоциации и высейте их на покровные стекла с покрытием PU 1 34 на девятый день процесса дифференцировки в присутствии безсывороточной среды для последующей сканирующей электронной микроскопии.

Изображения различных покрытых стеклянных покровных стекол показывают, что покрытие с использованием толуола или хлороформа было неоднородным, что проявлялось в виде неравномерного слоя с преципитацией PE 1 34. Напротив, тетрагидрофуран позволил нанести гораздо более однородную поверхность методом центрифугирования. Кроме того, анализ различных полимерных покрытий с помощью атомно-силовой микроскопии показал снижение шероховатости на 40% для P 1 34, растворенного в тетрагидрофуране, по сравнению с другими растворителями, что свидетельствует о более однородном покрытии PU 1 34. Для биологического применения была индуцирована дифференцировка печеночной энтодермы, и к девятому дню появились гепатобластоподобные клетки, причем большинство из них экспрессировали цитокератин 19, альфа-фетопротеин и ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа, а также низкие уровни альбумина как показателя метаболической функции.

Функция цитохрома P450 оценивалась через четыре дня после перепосева на поверхности с различным полимерным покрытием. Наблюдалось двукратное увеличение метаболической активности клеток, перепосеянных на поверхности с покрытием из тетрагидрофурана mpu 1 3 4. Эти результаты демонстрируют, что метаболическая активность гепатоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, повышается при более равномерном покрытии P 1 34. Контрастная визуализация не выявила существенных различий после УФ- или гамма-облучения, что было дополнительно подтверждено анализом с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Гепатоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека и перенесенные на стеклянные покровные стекла с покрытием PU 1 34, подвергнутым гамма-облучению, продемонстрировали трехкратное увеличение активности CYP 3A по сравнению с клетками, перенесенными на стекла с покрытием PU 1 34, подвергнутым УФ-облучению. Эти наблюдения доказывают, что гамма-излучение является оптимальным методом стерилизации. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости проверки гомогенности покрытия между различными образцами, полученными методом центрифужного напыления, а также помнить, что работа с оборудованием для химических растворителей может быть крайне опасной.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных очков.