Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4 ⁺ CD45RB ^{Высокая} Т-клеток в иммунодефицитных мышей

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы вызвать воспаление кишечника путем адоптивного переноса наивных Т-клеток в мышей с иммунодефицитом. Это достигается путем выделения клеток из селезенки мыши, лизиса клеток крови, а затем обогащения популяции для CD четырех положительных Т-клеток. Вторым шагом является маркировка этих клеток флуоресцентными DI-конъюгированными антителами CD 4 и CD 45 RB.

Затем меченые клетки сортируются с использованием фактов на популяции CD 45, RB low и CD 45 RB high. Заключительным этапом является перенос высоких клеток CD 45 RB мышам с иммунодефицитом путем внутрибрюшинной инъекции. В конечном счете, перенесенные клетки активируются и вызывают местное повреждение тканей в отсутствие Т-регуляторных клеток, что приводит к экспериментальному колиту.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении воспалительных заболеваний кишечника, такие как роль конкретных клеточных популяций и микробиоты желудочно-кишечного тракта в патогенезе заболевания. После усыпления мыши-донора опрыскайте брюшную полость 70% этанолом для стерилизации области. Затем сделайте горизонтальный разрез поперек живота и отклейте кожу, чтобы обнажить брюшину с помощью щипцов.

Держите брюшину подальше от внутренних органов и сделайте разрез в левой брюшной брюшине. Затем вырежьте селезенку из мыши и поместите ее в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров ледяного холода, полной среды. Раздавите селезенку двумя стерильными предметными стеклами, чтобы получилась одноклеточная суспензия.

Отфильтруйте клетки через ситечко 70 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, а затем промойте сетчатое фильтр пятью миллилитрами полного среднего напряжения до пяти селезенок в одной конической пробирке. Затем центрифугируйте клетки при 450 умноженных на G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость в контейнер для отходов, а затем осторожно ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах ледяного буфера для мечения.

Соедините 20 микролитров клеточной суспензии со 180 микролитрами 0,4%-ного раствора трианного синего и инкубируйте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в гемоцитометр и подсчитайте количество неголубых клеток под микроскопом, чтобы начать обогащение гранулы и аккуратно восстановите суспендию клеток в ледяном буфере для мечения в концентрации от 20 до 10 до шести клеток на миллилитр. Добавьте пять микролитров биотинилированного антитела для обогащения CD четырьмя Т-клетками в расчете на единицу 10 к шести клеткам, а затем инкубируйте клетки на льду с антителом в течение 15 минут.

Добавьте в клеточную суспензию в 10 раз больший объем меченого буфера, а затем центрифугируйте клетки при 450-кратном G в течение семи минут. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте сопряженные стрептавидином магнитные частицы путем вортексирования и добавьте пять микролитров частиц из расчета 10 раз на 10 к шести клеткам клеток.

Смешайте частицы с клетками, осторожно щелкнув пробиркой, а затем инкубируйте смесь при температуре от шести до 12 градусов Цельсия в течение 30 минут. Ресуспендируйте клетки до концентрации от 20 до 80 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр с меченым буфером. Затем перенесите один миллилитр меченых клеток в пробирку с круглым дном размером 12 на 75 миллиметров и поместите эту пробирку положительной фракции на магнит на шесть-восемь минут.

С помощью трубки на магните осторожно извлеките надосадочную жидкость стеклянной пастерной пипеткой, не потревожив помеченные клетки, и перенесите ее в новую стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Эта фракция содержит в CD четыре положительных Т-клетки. Извлеките пробирку положительной фракции из магнита и снова суспендируйте клетки в буфере для мечения путем энергичного пипетирования.

Верните трубку к магниту еще на шесть-восемь минут. Снова осторожно переложите SUP nain в пробирку с обогащенной фракцией. Увеличьте выход CD четырех положительных Т-клеток путем повторения обогащения по мере необходимости для подготовки клеток к мечению. Сначала центрифугируйте обогащенную фракцию в 450 раз больше G в течение семи минут и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем ресуспендируют клетки в меченом буфере до концентрации 10 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр. Аликвота пять умножить на 10 пятых клеток в отдельных микропробирках для неокрашенных изотопных и одинарно окрашенных контрольных клеток. Затем добавьте пять микрограммов на миллилитр CD 4, FE и один микрограмм на миллилитр антител CD 45 RB PE в пробирку, содержащую исходную клеточную суспензию.

Добавьте изотопные контрольные красители и одиночные красители в той же концентрации к соответствующим ячеистым аликвотам. Аккуратно смешайте клетки с антителами, а затем инкубируйте пробирки на льду в течение 30 минут. Накройте трубки крышкой, чтобы защитить их от света.

Затем дважды промойте клетки в буфере для мечения, как указано в текстовом протоколе, и повторно суспендируйте клетки в соотношении 10 умножить на 10 из шести клеток на миллилитр в буфере для мечения. Затем пропустите клеточную суспензию через сетчатый фильтр 70 микрон в факсимильную трубку. Поместите тюбик на лед и накройте его крышкой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание пятен.

Используйте неокрашенные и одноступенчатые контрольные ячейки для калибровки компенсации на сортировщике ячеек. Исключите нежизнеспособные ячейки с помощью прямого и бокового рассеяния стробов. Затем установите стробирование для CD четырех положительных и CD четырех RB положительных клеток с контролем, окрашенным изотопами.

Затем затворяем 4-положительную популяцию CD и затем сортируем клетки на популяции CD 45, RB высокие и CD 45 RB низкие. Соберите клетки в пробирки, содержащие два миллилитра полной среды, а затем запустите аликвоту примерно 10 раз по 10 до третьей клетки от каждой фракции на сортировщике клеток, чтобы оценить чистоту образца, подготовить CD 45 RB высокие и CD 45 RB низкие клетки для инъекционной промывки и ресуспендировать их в PBS до соответствующей плотности клеток, как указано в текстовом протоколе. Далее плотно зафиксируйте мышь-реципиента и введите 100 микролитров клеточной суспензии внутрибрюшинно в правую и левую стороны живота.

Каждую неделю наблюдайте за клиническими параметрами у мышей-реципиентов, как указано в текстовом протоколе. Прогрессирование заболевания после инъекции обычно проявляется на пятой неделе. Пожертвуйте мышью в заранее определенный момент времени или когда она потеряет 20% от своей начальной массы тела, и удалите толстую кишку.

Затем измерьте и запишите длину и вес толстой кишки. CD четыре положительных CD 45 RB высокие Т-клетки были перенесены мышам-реципиентам с одним нокаутом и NFIL с тремя RAG с одним двойным нокаутом через пять недель после инъекции. Мыши с двойным нокаутом потеряли 10% от своей первоначальной массы тела, ободки обоих тряпичных и двух нокаутов.

Мыши-реципиенты были утолщены и укорочены по сравнению с толстыми кишками от контрольных мышей CD четыре положительных CD 45 RB с высоким Т Т клетками для переноса на rag one knockout и rag one knockout p one 10 дельта мутантных мышей-реципиентов гистологический анализ через три недели после переноса показал эпителиальную гиперплазию, воспалительные клеточные инфильтраты и крипты абсцессы у реципиентов rag one knockout delta mutant, но не у мышей с нокаутом rag one после освоения. Эту технику можно выполнить за четыре-шесть часов, если она выполнена правильно.