Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Общая цель этой антиген-обусловленной модели колита состоит в том, чтобы определить, взаимодействуют ли CX3, CR1-положительные мононуклеарные фагоциты с CD4-положительными Т-клетками и активируют ли они их во время антиген-специфического колита, и происходит ли эта мононуклеарная фагоцит-зависимая эффекторная экспансия Т-клеток в собственной пластинке кишечника. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспалительных заболеваний кишечника, например, какие типы взаимодействия происходят в антигенпрезентирующих клетках и эффекторных Т-клетках в собственной пластинке толстой кишки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изучить взаимодействие иммунных клеток и элементов, которые приводят к возбудимости воспалительных заболеваний кишечника.

В этом методе используется модель переносного колита Т-клеток, при которой красные флуоресцентные антиген-специфические наивные CD4 Т-клетки переносятся к иммунодефицитному хозяину, экспрессируя зеленый флуоресцентный белок в мононуклеарных клетках. Перенос клеток осуществляется с помощью полости рта синих флуоресцентных антигенэкспрессирующих бактерий. Иммунные события, происходящие в собственной пластинке кишечника хозяина, можно контролировать на различных стадиях развития заболевания.

С помощью ножниц для вскрытия толстой кишки вскройте толстую кишку в продольном направлении и промойте ткань в чашке Петри, содержащей 25 миллилитров PBS, чтобы удалить любой мусор и слизь. Разрежьте толстую кишку на кусочки по пять-восемь миллиметров и поместите полученные фрагменты в 20 миллилитров свежего DPBS без кальция и магния, дополненного десятью миллимолярными HEPES и пятью миллимолярными EDTA. Пробирка с образцом вращается в течение 30 секунд на максимальной скорости.

Затем выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение десяти минут, слегка встряхивая, чтобы удалить эпителий. По окончании инкубации Vortex снова в течение 30 секунд. Затем выбросьте надосадочную жидкость, содержащую эпителиальные клетки.

Переложите кусочки ткани в новую пробирку, содержащую 20 миллилитров свежего PBS, HEPES и буфера EDTA, и повторите инкубацию с этапами вихревой обработки до и после. После третьего повторения удаляются все эпителиальные клетки и надосадочная жидкость очищается. Аккуратно промойте фрагменты ткани в PBS, чтобы удалить все остаточные эпителиальные клетки.

Разрежьте фрагменты ткани на две части по два миллиметра и перенесите кусочки для разложения в десять миллиметров среды RPI, дополненной 0,5 миллиграммами на миллилитр коллагеназы восьмого типа и десятью единицами на миллилитр ДНКазы одного. Сделайте сэмплы вихревыми в течение 30 секунд. Затем инкубируйте кусочки ткани при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 30-35 минут и делайте вихревые движения в трубке каждые пять минут во время инкубации.

Когда ткань переварится, процедите полученную кашицу через клеточное сетчатое фильтр 70 микрон в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Промойте сетчатый фильтр один раз и раскрутите одноклеточную суспензию путем центрифугирования. Наконец, промойте клетки один раз в PBS и центрифуге.

Затем определите количество жизнеспособных клеток с помощью исключения трипанового синего. Голубой флуоресцентный белок овальбумин, продуцирующий белок e. coli, активирует продукцию интерферона гамма в клетках OT-II in vitro в отличие от e.

кишечная палочка, экспрессирующая только СЛФ. Конфокальная 3D-визуализация ex vivo ткани толстой кишки трансгенных зеленых флуоресцентных белков, экспрессирующих мыши, которых кормили яйцем PCFP E. coli, демонстрирует присутствие флуоресцентных белков-экспрессирующих бактерий в криптах толстой кишки вблизи эпителиальных клеток кишечника и совместно локализованных с фагоцитами кишечника хозяина.

У красных животных OT-II CD4-положительные Т-клетки характеризуются совместной экспрессией красного флуоресцентного белка и бета-V-5 целых 1 целых. При воздействии на яйцеклетку e. coli PCFP трансгенные мыши с дефицитом BNT-лимфоцитов зеленые флуоресцентные белки, экспрессирующие белки, которым были адоптивно трансплантированы красные CD4-положительные CD62-лиганд-положительные Т-клетки OT-II, быстро теряют массу тела и развивают клинические признаки колита.

Через семь дней после переноса клеток только несколько фагоцитов хозяина взяли образцы яйцеклеток e. coli PCFP, и эритроположительные клетки OT-II не обнаруживаются. Через 14 дней после переноса клеток фагоциты хозяина, которые взяли образцы e.

Яйцеклетки PCFP coli расположены в непосредственной близости от адоптивно перенесенных эритроположительных клеток OT-II. К 21 дню после переноса клеток большое количество клеток-хозяев отбирает образцы яйцеклеток e. coli PCFP, и донорские эритроположительные клетки OT-II, которые диспергированы по собственной пластинке толстой кишки, находятся в тесном контакте с фагоцитами кишечника хозяина.

Освоив эту технику, она может быть выполнена за четыре часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание кишечных лимфоцитов и анализ цитокинов сыворотки крови, чтобы ответить на дополнительные вопросы о состоянии активации CD4 Т-клеток и подтвердить тяжесть колита. После каждой разработки этот метод прокладывает путь для исследований в области иммунологии для изучения небольших событий, которые приводят к воспалительным заболеваниям кишечника у мышиной модели.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выделить собственные иммунные клетки толстой кишки для последующего анализа ex vivo.