Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам
18 сентября 2016 г.
В этой модели колита, вызванного антигеном, CD4+ Т-клетки OT-II, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, были адоптивно перенесены мышам RAG-/-, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в мононуклеарных фагоцитах (МП). Хозяев подвергали воздействию Escherichia coli (E.coli), экспрессирующей белок овальбумин (OVA), слитый с голубым флуоресцентным белком (CFP).
Общая цель данной модели антиген-индуцированного колита заключается в том, чтобы определить, взаимодействуют ли CX3- и CR1-положительные мононуклеарные фагоциты с CD4-положительными Т-клетками и активируют ли они их при антиген-специфическом колите, а также происходит ли эта зависимая от мононуклеарных фагоцитов экспансия эффекторных Т-клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области воспалительных заболеваний кишечника, например, о том, какие типы взаимодействия происходят между антигенпрезентирующими клетками и эффекторными Т-клетками в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки. Основным преимуществом этой методики является возможность изучения взаимодействия иммунных клеток и факторов, приводящих к патогенезу воспалительных заболеваний кишечника.
В данном методе используется модель колита, индуцируемого переносом Т-клеток, при которой красные флуоресцентные антигенспецифические наивные Т-клетки CD4 переносят иммунодефицитному реципиенту, в мононуклеарных клетках которого экспрессируется зеленый флуоресцентный белок. После переноса клеток проводят пероральное введение синих флуоресцентных антиген-экспрессирующих бактерий с помощью зонда. Иммунные события, происходящие в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника реципиентов, можно отслеживать на различных стадиях развития заболевания.
С помощью диссекционных ножниц разрежьте ободочную кишку вдоль и промойте ткань в чашке Петри, содержащей 25 миллилитров PBS, чтобы удалить остатки содержимого и слизь. Разрежьте ободочную кишку на фрагменты размером от пяти до восьми миллиметров и поместите полученные фрагменты в 20 миллилитров свежего DPBS без кальция и магния, дополненного десятью миллимолярными HEPES и пятью миллимолярными EDTA. Перемешайте пробирку с образцом на вортексе в течение 30 секунд на максимальной скорости.
Затем инкубируйте при 37 °C в течение десяти минут при осторожном перемешивании для удаления эпителия. По окончании инкубации снова перемешайте на вортексе в течение 30 секунд. Затем удалите супернатант, содержащий эпителиальные клетки.
Перенесите фрагменты ткани в новую пробирку, содержащую 20 milliliters свежего буфера PBS, HEPES и EDTA, и повторите инкубацию с этапами перемешивания на вортексе до и после. После третьего повторения все эпителиальные клетки удаляются, и супернатлант становится прозрачным. Осторожно промойте фрагменты ткани в PBS, чтобы удалить остатки эпителиальных клеток.
Разрежьте фрагменты ткани на кусочки размером 2 по 2 мм и перенесите их для переваривания в 10 мл среды RPI, дополненной коллагеназой 8-го типа в концентрации 0,5 мг/мл и ДНКазой I в концентрации 10 ед/мл. Перемешайте образцы на вортексе в течение 30 секунд. Затем инкубируйте кусочки ткани при 37 °C с встряхиванием в течение 30–35 минут, перемешивая содержимое пробирки на вортексе каждые пять минут в процессе инкубации.
После переваривания ткани профильтруйте полученную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 70 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Один раз промойте фильтр и осадите суспензию одиночных клеток путем центрифугирования. В завершение один раз промойте клетки в PBS и центрифугируйте.
Затем определите количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего. E. coli, продуцирующие белок овальбумин с голубым флуоресцентным белком, активируют выработку интерферона гамма в клетках OT-II in vitro, в отличие от e.
coli, экспрессирующие только CFP. Конфокальная 3D-визуализация ex vivo тканей толстой кишки трансгенных мышей, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок и получавших e. coli PCFP ova, демонстрирует наличие бактерий, экспрессирующих флуоресцентный белок, в криптах толстой кишки рядом с эпителиальными клетками кишечника и колокализацию с фагоцитами кишечника хозяина.
У животных OT-II red CD4-положительные T-клетки характеризуются коэкспрессией красного флуоресцентного белка и V beta 5.1. При воздействии E. coli PCFP ova трансгенные мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок с дефицитом BNT-лимфоцитов, которым были пересажены OT-II red CD4-положительные CD62L-положительные T-клетки, быстро теряют вес и развивают клинические признаки колита.
Спустя семь дней после переноса клеток лишь несколько фагоцитов реципиента поглотили овы e. coli PCFP, и красные положительные клетки OT-II не обнаруживаются. Через 14 дней после переноса клеток фагоциты реципиента, которые поглотили e.
OVA PCFP E. coli расположены в непосредственной близости от адоптивно перенесенных OT-II red-положительных клеток. К 21-му дню после переноса клеток большое количество клеток реципиента захватили OVA PCFP E. coli, а донорские OT-II red-положительные клетки, рассредоточенные по всей собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки, находятся в тесном контакте с кишечными фагоцитами реципиента.
При должном навыке эта процедура при правильном выполнении занимает четыре часа. После ее завершения можно применить другие методы, такие как окрашивание лимфоцитов кишечника и анализ цитокинов в сыворотке, чтобы получить дополнительные данные о состоянии активации T-клеток CD4 и подтвердить степень тяжести колита. По мере совершенствования данная методика открывает возможности для исследований в области иммунологии по изучению факторов, приводящих к развитию воспалительного заболевания кишечника на мышиной модели.
После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выделять иммунные клетки собственной пластинки слизистой оболочки толстой кишки для последующего анализа ex vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используется модель антиген-индуцированного колита для изучения взаимодействий между CX3-, CR1-положительными мононуклеарными фагоцитами и CD4-положительными T-клетками. Эта модель позволяет отслеживать иммунные события в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника в процессе развития заболевания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Воспалительные заболевания кишечника
- Клеточные взаимодействия
Обзор
- Понимание роли одноядерных фагоцитов в активации T-клеток.
- Изучение взаимодействий иммунных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки.
- Исследование патогенных механизмов при воспалительных заболеваниях кишечника.
- Использование флуоресцентных белков для отслеживания иммунного ответа.
Цель исследования
- Определить взаимодействие между одноядерными фагоцитами и T-клетками CD4.
- Оценить экспансию эффекторных T-клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника.
- Изучить механизмы развития воспалительных заболеваний кишечника.
Используемые методы
- Адоптивный перенос Т-клеток CD4+ линии OT-II мышам RAG -/-.
- Использование флуоресцентных белков для маркировки иммунных клеток.
- Пероральное зондирование E.coli, экспрессирующей овальбумин, слитый с CFP.
- Мониторинг иммунных событий на различных стадиях заболевания.
Основные результаты
- Идентификация взаимодействий между одноядерными фагоцитами и Т-клетками.
- Доказательства экспансии эффекторных Т-клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника.
- Понимание патогенности воспалительных заболеваний кишечника.
- Демонстрация полезности модели колита, индуцированного переносом Т-клеток.
Выводы
- В исследовании освещены критические взаимодействия в иммунном ответе при колите.
- Полученные результаты способствуют пониманию механизмов воспалительных заболеваний кишечника.
- Данная модель создает основу для будущих исследований в области иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эта модель антиген-индуцированного колита позволяет детально изучить механизмы взаимодействия антигенпрезентирующих клеток и T-клеток в определенном иммунологическом контексте, что способствует валидации мишеней при исследовании воспалительных заболеваний кишечника. Обеспечивая воспроизводимую систему для изучения патогенного взаимодействия иммунных клеток в lamina propria, данная модель повышает прогностическую точность при доклинической оценке рисков иммуномодулирующих препаратов-кандидатов. Модель соответствует рабочим процессам ранних стадий поиска, направленным на выяснение сигнальных путей и взаимодействие с биологическими мишенями.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся антигенспецифической активации T-клеток мононуклеарными фагоцитами.
- Практическая ценность: предоставляет определенную антиген-зависимую систему для выяснения биологических путей, участвующих в патогенезе колита.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем изоляции событий экспансии эффекторных T-клеток в тканях кишечника.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: создание валидированных биологических систем с флуоресцентно мечеными иммунными клетками для последующего анализа ex vivo.
- Количественные показатели: возможность измерения взаимодействий иммунных клеток и продукции цитокинов в ответ на воздействие определенного антигена.
- Воспроизводимость: стандартизированное выделение клеток и обработка тканей обеспечивают стабильный мониторинг иммунных событий в разных экспериментальных повторностях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует антиген-зависимое воспаление кишечника для изучения механизмов, имеющих отношение к подтипам воспалительных заболеваний кишечника.
- Трансляционная преемственность: Связывает данные об иммунных взаимодействиях, полученные на этапе поиска, с доклинической валидацией терапевтических кандидатов.
- Принятие решений с учетом рисков: Облегчает оценку взаимодействия с мишенью и механистических эффектов до этапа оптимизации ведущего соединения.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод способствует ранним этапам биологических исследований, позволяя проверять гипотезы о функциях антигенпрезентирующих клеток в активации Т-клеток, что предшествует этапам идентификации соединений-лидеров. Он позволяет получать количественные данные об иммунных событиях, которые полезны для аналитического сравнения экспериментальных условий при иммунологическом скрининге. Система спроектирована как многоразовая платформа для изучения иммуноопосредованных путей в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей антиген-специфических иммунных ответов в кишечнике.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые протоколы изоляции и стимуляции иммунных клеток для оценки соединений или модуляторов.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели, такие как выработка интерферона гамма и локализация иммунных клеток, для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: связывают понимание механизмов с доклинической преемственностью посредством определенного моделирования заболеваний, вызванных антигенами.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс для изучения взаимодействий между АПК и Т-клетками, применимый к множеству иммунологических мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях взаимодействий иммунных клеток.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря четко определенным протоколам антигенного вызова и переноса клеток.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности ранней оценки биологических эффектов, опосредованных мишенью.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе данных об иммунных событиях в собственной пластинке слизистой оболочки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммунологии, проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для выделения и анализа иммунных клеток.
- Зависит от наличия трансгенных моделей мышей, бактерий, экспрессирующих флуоресцентные белки, и оборудования для обработки тканей кишечника.
- Необходима межгрупповая стандартизация сроков переноса клеток, дозирования антигена и графиков сбора тканей.
- При адаптации метода следует учитывать совместимость системы модели с различными антигенспецифическими Т-клеточными рецепторами и маркерами фагоцитов.
- Практические ограничения включают техническую сложность выделения клеток собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria) и необходимость многодневного мониторинга развития заболевания.
