Системы HeLa основе сотового свободное выражение для выражения Плазмодий Rhoptry Белки

Общая цель данного эксперимента заключается в трансляции белков плазмодия с использованием бесклеточных экспрессионных систем на основе hela и в очистке белков от микрообъемов транслируемого продукта. Это достигается путем клонирования генов плазмодия для получения рекомбинантных плазмид для двухступенчатой и одноступенчатой трансляции in vitro, бесклеточной экспрессии малярийных рекомбинантных белков RT-дерева. Для трансляции рекомбинантных белков подготовленную плазмиду инкубируют с транскрипционной смесью.

При использовании двухступенчатой системы экспрессии, которая транскрибирует мРНК, полученная мРНК затем добавляется в трансляционную смесь для трансляции белка. При использовании одноступенчатой системы экспрессии рекомбинантную плазмиду инкубируют с лизатом клеток хела для транскрипции и трансляции рекомбинантных белков. Затем рекомбинантные белки очищаются из микрообъемов продукта трансляции.

Результаты показывают успешную экспрессию и очищение на основе вестерн-блоттинг-анализа. Основное преимущество этой методики перед другими, такими как система экспрессии зародышей пшеницы и система лизата ретикулоцитов кролика, заключается в том, что эта система может экспрессировать белки за три часа. Оптимизация кодирования не требуется.

Он доступен по цене и прост в использовании. На микрочипах можно проводить скрининг нескольких антигенов, что делает возможным обнаружение антигенов для терапии и диагностики. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что это внеклеточная экспрессия, которая экспрессирует белки в микрообъемах, что делает очистку белка чрезвычайно сложной.

Сначала у нас возникла идея использовать эту систему, так как мы не могли исследовать экспрессионные белки с помощью кишечной палочки, а другие системы экспрессии показались нам слишком дорогими и трудоемкими. Мы решили изучить систему бесклеточной экспрессии на основе hela в качестве альтернативной системы. Приготовьте 20 микролитров транскрипционной смеси, содержащей рекомбинантную плазмидную векторную ДНК, как описано в текстовом протоколе, для двухступенчатой экспрессии белка человека in vitro.

Использование ДНК-шаблонов. Смешайте компоненты в микроцентрифужной пробирке и выдержите 75 минут при температуре 30 градусов Цельсия на водяной бане. Затем возьмите два микролитра транскрипционной смеси и добавьте ее к 23 микролитрам транскрипционной смеси, содержащей лизат хела-клеток.

Полученную смесь инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия в течение 90 минут. Храните переведенные продукты при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем приготовьте 25 микролитров транскрипционно-трансляционной смеси, содержащей рекомбинантный плазмидный вектор, ДНК и лизат, как описано в текстовом протоколе, для одноэтапной экспрессии трансляционного белка человека in vitro для матриц ДНК.

Инкубируйте эту реакционную смесь от 90 минут до шести часов при температуре 30 градусов Цельсия и храните продукты трансляции при температуре минус 20 градусов Цельсия. Для очистки экспрессированных рекомбинантных белков добавьте 75 микролитров одного Х-буфера очистки к 25 микролитрам продукта трансляции, чтобы получить 100 микролитров очищающей смеси. Промойте никелевую смолу дважды, добавив 300 микролитров дистиллированной воды и 300 микролитров связующего буфера.

Повторно суспендируйте смолу и центрифугуйте при давлении 14 000 G на одну минуту для удаления избытка этанола. Далее в 100 микролитров никелевой хелатирующей смолы добавляют 100 микролитров приготовленного очищающего раствора, и инкубируют смесь в конце. Закончите шейкер на 60 минут при комнатной температуре.

Центрифугируйте смесь при давлении 14 000 G в течение одной минуты и соберите супернат в свежую пробирку с маркировкой «проточный». Промойте смолу 100 микролитрами одного буфера для промывки, затем центрифугируйте при 14 000 GS в течение одной минуты и соберите названный супер в свежую пробирку с маркировкой wash. Повторите этот шаг дважды после стирки.

Добавьте в смолу 100 микролитров одного буфера для элюирования и выдерживайте в шейкере в течение 15 минут. Затем центрифугируйте при давлении 14 000 G в течение одной минуты. Каждый раз выполняйте эллуцианский шаг дважды.

Соберите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку и пометьте как элюировать после эллуциана. Промойте смолу дважды, как и раньше, а затем храните ее при температуре четыре градуса Цельсия. Храните поток через смывки и элюирующие образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия или ниже для выполнения западного блоттинга.

Сначала готовят отдельные пробирки экстрактов Шона из P. falsy parum e coli, экспрессированных рекомбинантных R-трех белков, полученных рекомбинантных белков и белковых продуктов, очищенных аффинным методом. Затем добавьте в каждую пробирку буфер для образцов электрофореза, содержащий меркаптоэтанол, чтобы получить конечный объем 20 микролитров. Для получения образцов растворимого белка пробирки кипятят в течение двух минут.

Загрузите образцы солюбилизированных белков на 10%-ные гели SDS, чтобы отделить белки после запуска гелей. Перенесите отделенные белки из гелей страницы SDS на нитроцеллюлозную бумагу с помощью электрофореза при токе 35 миллиампер на гель в полусухой западной промокательной камере в течение двух часов после переноса и блокирования нитроцеллюлозной бумаги 2%-ным обезжиренным молоком. Инкубируйте нитроцеллюлозную бумагу с поликлональными антителами, перечисленными в текстовом протоколе, для получения отрицательного контроля.

Также инкубируют нитроцеллюлозную бумагу в 100 разбавленной нормальной сыворотке мышей и кроликов и отработанной культуре супер, названной из двух клеток миеломы SB. После инкубации нитроцеллюлозной бумаги при четырех градусах Цельсия в течение ночи четыре раза промывали буфером для блоттинга и инкубировали видоспецифичными вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, разведенными до 1000 в 2% молоке. Затем снова четыре раза промыть нитроцеллюлозную бумагу с буфером для кляксы.

Наконец, инкубировать промытую нитроцеллюлозную бумагу с раствором для проявления цвета, А плюс В в течение 30 минут в темноте, успешная экспрессия белков плазмодия с использованием систем безклеточной экспрессии человека in vitro была подтверждена RT tree, специфичным для кролика антиером, как было показано ранее, экспрессированные рекомбинантные белки не были распознаны антисыворотками против паразитоза вае белки из p FALs parem и P Yoi Lee, Демонстрация специфичности антисывороток кролика 6 76 в отношении экспрессируемых белков. Нормальная сыворотка кролика не вступала в реакцию с рекомбинантными белками. Переводится с использованием двухступенчатой системы безклеточной экспрессии человека in vitro и одноступенчатой сопряженной системы трансляции in vitro.

Здесь показана успешная очистка транслируемых белков от 25 микролитров транслируемых белковых продуктов. В частности, показана успешная очистка трансмембранного белка расщелины мары. Также показана успешная очистка гипотетического белка из генов, кодирующих гены белка дерева Plasmodium RT.

Наконец, показана успешная очистка повторов броненосца, содержащих белок дерева Plasmodium RT. Выход белка после очистки составляет 3,5 микрограмма на 25 микролитров после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области паразитологии для определения характеристик белков у паразитов, белковых взаимодействий, исследований ингибиторов антител и разработки вакцин в области паразитологии.

После просмотра этого видео вы должны понять, как использовать бесклеточную систему экспрессии клеток healer для экспрессии белков плазмодия за три часа. Вы также будете иметь представление о том, как очистить белки от микрообъемов переведенного продукта.