Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации киназ, которые фосфорилируют интересующий субстрат, с использованием методов высокопроизводительного скрининга. Это достигается путем первоначальной трансфекции клеток плазмидами, экспрессирующими киназы, слитые с глутатион-S-трансферазой (GST). Вторым этапом является проведение осаждения (pulldown) киназы с помощью GST.

Затем образцы вносят в гели, которые подвергают электрофорезу и окрашивают красителем кумасси бриллиантовый синий. Заключительным этапом является высушивание гелей и их экспозиция на авторадиографическую пленку. В конечном итоге, путем проявления и интерпретации полученных пленок, можно идентифицировать пары киназа-субстрат, так как каждая дорожка соответствует отдельному анализу киназной активности.

Существующие методы идентификации киназы для известного фосфорилированного субстрата включают использование биоинформатических подходов для поиска консенсусного сайта в субстрате, обнаружение комплексов между киназой и субстратами с помощью биохимических методов и метода проб и ошибок, а также поиск консенсусных субстратов на основе их известной биологической функции. Эти подходы требуют много времени и не всегда оказываются успешными. Наш подход позволяет быстро идентифицировать пары киназа-субстрат на основе функциональных результатов.

Когда мы впервые задумали этот метод, мы опасались, что специфичность in vitro будет недостаточной. Как выяснилось, субстратная специфичность отличная, и в ходе скрининга мы часто обнаруживаем, что только киназы одного семейства способны фосфорилировать данный субстрат. Это особенно заметно при мультиплексном анализе с использованием нескольких субстратов в каждом скрининге, что доказывает эффективность процедуры. Кортни, техник из моей лаборатории, начнет процедуру с подготовки реагентов, планшетов и клеток, как описано в текстовом протоколе.

Если планшеты с плазмидами киназы были заморожены, разморозьте их при комнатной температуре и центрифугируйте при 1900 ×g в течение трех минут, чтобы собрать конденсат на дне лунок. Смешайте 8,6 мл среды с пониженным содержанием сыворотки с 312,7 мкл липидного реагента для трансфекции и оставьте смесь на пять минут. Добавьте по 10 мкл этой смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего плазмиды киназы.

Используя автоматический диспенсер жидкостей, оснащенный кассетой для малых объемов, добавьте в каждую лунку по 10 µL смеси реагента для трансфекции в среде с пониженным содержанием сыворотки, и оставьте планшет на 20–45 минут. Затем ресуспендируйте клетки 293T в концентрации 0,75 млн клеток/мл в 80 мл модифицированной среды DMEM с добавлением Delcos или DMEM, и внесите по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку. Используя автоматический диспенсер жидкостей, оснащенный кассетой для стандартных объемов, проверьте равномерность распределения клеток в лунках под микроскопом, после чего верните планшет в инкубатор при 37 °C на 24 часа.

Для начала эксперимента по осаждению киназы с помощью GST приготовьте раствор ванадата с концентрацией 4 мМ, смешав 60 мкл 0,2 М ванадата натрия с 540 мкл воды; во второй пробирке смешайте 2,7 мкл 30% перекиси водорода и 1,4 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Соедините два раствора и оставьте смесь на 15 минут перед использованием.

С помощью многоканального дозатора внесите по 2 µL 0,25 M хлорида кальция в каждую лунку, затем добавьте по 2,5 µL проверенного раствора даты. Инкубируйте каждый планшет при 37 °C в течение 10 минут, после чего поместите планшеты на лед и поддерживайте их в охлажденном состоянии. Удалите среду из каждой лунки с помощью вакуума и немедленно добавьте по 50 µL ледяного лизирующего буфера в каждую лунку.

Используя автоматический диспенсер жидкости, оснащенный стандартной кассетой, оставьте планшет на льду на 30 минут для лизиса. После центрифугирования планшетов при 1900 ×g в течение трех минут при температуре 4 °C соберите клетки из каждой лунки с помощью многоканального дозатора и перенесите все содержимое в соответствующим образом маркированные пробирки. Центрифугируйте 96-луночные планшеты при 1900 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C; во время центрифугирования заполните планшеты с покрытием из глутатиона ледяным буфером для лизиса в объеме 100 µL на лунку.

Для промывки держите планшеты на льду. После центрифугирования нижних планшетов переверните планшеты с глутатионом над раковиной, чтобы вытряхнуть лизирующий буфер, и промокните бумажным полотенцем. Перенесите лизирующий буфер из V-образных планшетов в планшеты с глутатионом, наклонив планшет и используя многоканальный дозатор, стараясь не задеть осадок на дне.

Затем накройте планшеты и оставьте на льду минимум на два часа. Ближе к завершению двухчасового этапа связывания подготовьте рабочую станцию для работы с радиоактивными изотопами, обеспечив соблюдение всех необходимых мер предосторожности. Установите температуру в печи для гибридизации на 30 °C.

Переверните планшеты с глутатионом над раковиной, чтобы удалить буфер для лизиса, и промокните бумажным полотенцем. Промойте лунки трижды 100 microliters буфера для лизиса без PMSF. Не допускайте высыхания лунок.

Оставьте их в промывочном растворе до начала следующего этапа. Затем приготовьте 55 milliliters 1X киназного буфера (1X KB) согласно текстовому протоколу. С помощью автоматического дозатора жидкости, оснащенного кассетой стандартного объема, добавьте по 50 microliters 1X KB в каждую лунку планшета.

Затем приготовьте раствор А, содержащий интересующий субстрат и основной белок миелина или MVP, следуя инструкциям текстового протокола для каждого компонента по отдельности. Переверните планшеты над раковиной, чтобы удалить промывочный раствор 1X KB на бумажное полотенце, и немедленно добавьте 30 µL раствора А с помощью автоматического диспенсера, оснащенного кассетой для малых объемов. Держите планшеты на льду.

Затем в зоне работы с радиоактивными материалами приготовьте раствор B, как описано в текстовом протоколе, из расчета 20 µL раствора B на лунку. Используя репитирующую пипетку, которая способствует перемешиванию за счет силы выброса жидкости, накройте планшет и инкубируйте его в гибридизационном печи при 30 °C в течение 30 минут. По истечении 30 минут перенесите планшеты обратно на лед.

Затем с помощью многоканального дозатора добавьте в каждую лунку 50 µL 2x лизирующего буфера SDS (додецилсульфат натрия). Все работы в данном разделе следует проводить в зоне, предназначенной для работы с радиоактивными материалами. Включите печь для гибридизации и установите температуру 85 °C.

Когда духовой шкаф достигнет заданной температуры, перенесите планшеты в него и инкубируйте в течение 10 минут для денатурации образцов. Затем внесите по 15 µL каждой реакции в лунки готовых гелей на 26 лунок.

При использовании многоканального дозатора для одновременного заполнения нескольких лунок необходимо следить за тем, чтобы все наконечники совпадали с соответствующими лунками. Перед внесением образцов проведите электрофорез геля при 150 вольтах. Не допускайте выхода синей линии за нижнюю границу геля, так как она содержит несвязавшийся ATP. Затем извлеките гели и удалите несвязавшийся ATP, поскольку он может привести к затемнению геля при экспонировании пленок.

Поместите гели в маркированные контейнеры и залейте красителем Кумасси на 15 минут. Затем удалите краситель Кумасси. Кратковременно промойте гели водой и добавьте раствор для обесцвечивания.

Выдерживайте гели до тех пор, пока белки не станут четко видны. Для каждого образца должна быть видна полоса MVP и полоса субстрата. Для сушки гелей вырежьте большой лист фильтровальной бумаги и поместите его на сушилку.

Смочите лист целлофана в дистиллированной воде до тех пор, пока он не станет гладким и без складок, и положите его поверх бумаги. Разместите гели на листе целлофана, отметив их порядок. Смочите второй лист целлофана и положите его поверх гелей.

Удалите все пузырьки воздуха, чтобы получить однородную поверхность. Закройте крышку, включите вакуум и сушите гели в течение трех часов при 80 °C. После высыхания гелей экспонируйте их на двойную эмульсионную авторадиографическую пленку, используя усиливающий экран для усиления сигнала.

Оберните кассету пищевой пленкой или поместите в пластиковый пакет и загерметизируйте лентой, чтобы предотвратить образование инея, перед хранением кассеты при температуре -80 °C в течение ночи. На следующий день извлеките кассету из морозильной камеры и дайте ей оттаять при комнатной температуре. Проявите пленку в темной комнате с помощью проявителя для пленки в соответствии с приведенными инструкциями производителя.

Ниже представлены репрезентативные результаты скрининга 180 киназ с использованием пептидного субстрата с GST-меткой, соответствующего аминокислотам с 268 по 283 Kreb-регулируемого транскрипционного коактиватора 2 (CRTC2), а также классического субстрата для анализа киназной активности — основного белка миелина (MBP). Только две киназы, MARK2 и тесно связанная с ней MARK3, фосфорилировали пептид CRTC2. MBP включен во все анализы в качестве внутреннего контроля, так как он содержит множество остатков, доступных для фосфорилирования, и имеет молекулярную массу 18 кДа, смещаясь к нижней части геля.

Это позволяет интерпретировать специфичность. Некоторые киназы будут активно фосфорилировать субстрат и MVP. Следует отметить, что в лунках, содержащих только GST, всегда очищается некоторая эндогенная киназная активность.

Таким образом, в анализе всегда присутствует фоновое фосфорилирование. Хотя это не исключает того, что фосфорилирование субстрата является реальным процессом, это указывает на то, что в условиях in vitro киназа может быть менее селективной. Для формулирования выводов относительно субстратной специфичности киназы особенно информативно использование нескольких субстратов с различной молекулярной массой.

Поскольку скрининг проводится in vitro, а в условиях in vivo возникают дополнительные уровни сложности, киназу-кандидат необходимо валидировать в клетках. Например, киназа-кандидат может обладать способностью фосфорилировать субстрат in vitro, но при этом она может не экспрессироваться в том же типе клеток или в тех же субклеточных компартментах, что и субстрат. Обычно это выполняется с помощью РНК-интерференции (RNAi) для сайленсинга гена кандидата.

Также можно провести вторичный скрининг с использованием нефосфорилируемого мутанта субстрата для подтверждения специфичности.