Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации киназ, которые фосфорилируют представляющий интерес субстрат, с использованием высокопроизводительных методов скрининга. Это достигается путем первого пересечения клеток с плазмидами, экспрессирующими киназы FU, в глутатион в виде трансферазы или GST. Вторым шагом является вытягивание киназы GST.

Затем образцы загружаются в гели, которые затем запускаются и окрашиваются блестящим синим красителем кумаси. Заключительным этапом является сушка гелей и воздействие на них авторентгенографической пленки. В конечном счете, разрабатывая и интерпретируя полученные пленки, можно идентифицировать пары киназного субстрата, поскольку каждая полоса является репрезентативной для отдельного киназного анализа.

Существующие методы идентификации киназы для известного фосфорилированного субстрата включают использование биоинформатических подходов для поиска консенсусного сайта в субстрате, обнаружение комплексов между киназой и субстратами с использованием биохимических методов и метод проб и ошибок, поиск консенсусных субстратов conte на основе их известной биологической функции. Эти подходы отнимают много времени и не всегда увенчаются успехом. Наш подход позволяет быстро идентифицировать пары киназного субстрата на основе функциональных исходов.

Когда у нас впервые появилась идея этого метода, мы были обеспокоены тем, что у него не будет достаточной специфичности. Как оказалось, специфичность субстрата превосходна, и мы часто обнаруживаем, что только киназы членов семейства способны фосфорилировать данный субстрат в экране. Это особенно очевидно, когда мы мультиплексируем с использованием нескольких субстратов на каждом экране, демонстрируя процедуру Кортни, техник из моей лаборатории.

Если планшеты, содержащие плазмиды киназы, были заморожены, разморозьте при комнатной температуре и центрифугируйте при 1900 G в течение трех минут, чтобы собрать любую влагу на дне лунок. Смешайте 8,6 миллилитров восстановленной сыворотки с 312,7 микролитрами реагента для трансфекции на основе липидов и дайте смеси настояться в течение пяти минут в каждой лунке. Из 96 лунок планшет содержит киназные плазмиды в дозе 10 микролитров восстановленной сывороточной среды.

С помощью автоматического дозатора жидкости, оснащенного кассетой небольшого объема, добавьте 10 микролитров смеси реагентов для трансфекции восстановленной сыворотки сыворотки в лунку, используя автоматический дозатор жидкости, оснащенный кассетой небольшого объема, и дайте планшету постоять от 20 до 45 минут. Затем ресузи суспендируют 2 93 Т-клетки в концентрации 0,75 млн клеток на миллилитр в 80 миллилитрах полной модифицированной delcos или DMEM в концентрации 100 микролитров клеточной суспензии на лунку. С помощью автоматического дозатора жидкости, оснащенного кассетой стандартного объема, проверьте лунки под микроскопом на равномерное распределение клеток, прежде чем вернуть планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 24 часа.

Чтобы начать эксперимент по снижению киназы GST. Приготовьте раствор с четырьмя миллимолярами на ванадат, смешав 60 микролитров 0,2 моляра ванадата натрия с 540 микролитрами воды во второй пробирке, смешайте 2,7 микролитра 30% перекиси и 1,4 миллилитра фосфатно-солевого буфера или PBS. Добавьте два раствора вместе и дайте смеси настояться в течение 15 минут перед использованием.

С помощью многоканальной пипетки дозируйте по два микролитра 0,25 молярного хлорида кальция в каждую лунку, а затем 2,5 микролитра проверенного раствора для сбора фиников. Выдержите каждую пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем положите на лед, держа пластины на льду. Удалите среду из каждой лунки, используя вакуум немедленно в количестве 50 микролитров на лунку ледяного буфера для лизиса.

С помощью автоматического дозатора жидкости, оснащенного стандартной кассетой, дайте пластине постоять на льду в течение 30 минут, чтобы получить вшей. После вращения планшетов при температуре 1900 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия соскребите клетки из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и перенесите все содержимое в соответствующую маркировку vbo. 96 лунок планшеты вращают пластины при температуре 1900 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, во время вращения заполняют пластины, покрытые глутатионом, 100 микролитрами на лунку ледяного буфера для лизиса.

В качестве полоскания держите тарелки на льду. После центрифугирования нижних пластин переверните пластины с глутатионом над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер для лизиса, и промокните на бумажном полотенце. Перенесите буфер для лизиса с V-образных нижних пластин на пластины с глутатионом, наклонив пластину и используя многоканальную пипетку, стараясь не повредить гранулу на дне.

Затем накройте тарелки крышками и оставьте на льду минимум на два часа. Чтобы связать ближе к концу двухчасового этапа привязки, подготовьте рабочую станцию по радиоактивности, обеспечив необходимые меры безопасности при радиоактивных работах. Установите печь для гибридизации на 30 градусов Цельсия.

Переверните пластины с глутатионом над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер для лизиса, и промокните на бумажном полотенце. Трижды промойте лунки 100 микролитрами буфера для лизиса без PMSF. Не позволяйте колодцам высохнуть.

Держите их в полоскании до тех пор, пока не будете готовы продолжить. Далее приготовьте 55 миллилитров одного Х-киназного буфера или одного Х Кб, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 50 микролитров одного х кб в каждую лунку пластины с помощью автоматического дозатора жидкости, оснащенного кассетой стандартного объема.

Затем приготовьте раствор А, приготовив раствор, содержащий интересующий субстрат и основной белок миелина или ПМК, как подробно описано в текстовом протоколе, по одному. Переверните пластины над раковиной, чтобы удалить один участок для полоскания XKB на бумажное полотенце и сразу же добавьте 30 микролитров раствора А. С помощью автоматического дозатора жидкости оснащен кассетой небольшого объема. Держите тарелки на льду.

Затем приготовьте раствор Б в рабочей зоне радиоактивности, как описано в текстовом протоколе, из расчета 20 микролитров раствора Б на лунку. С помощью пипетки-репитера, которая помогает смешивать благодаря крышке с усилием выброса, инкубируйте планшет в печи для гибридизации при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут переложите пластины обратно на лед.

Затем добавьте по 50 микролитров двух x эккле-сульфата натрия или буфера для лизиса SDS в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Все работы на этом участке должны выполняться в зоне, предназначенной для радиоактивности. Включите духовку для гибридизации и установите ее на 85 градусов по Цельсию.

Как только духовка нагреется, перенесите пластины в духовку и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы денатурировать образцы. Следующая загрузка. 26 хорошо готовых гелей с 15 микролитрами каждой реакции.

Используя многоканальную пипетку для заполнения нескольких лунок одновременно, необходимо следить за тем, чтобы все наконечники совпадали с соответствующими лунками. Перед добавлением образцов запустите гель при напряжении 150 вольт. Не позволяйте синей линии стекать с нижней части геля, так как она содержит неинкорпорированный A TP. Затем демонтируйте гели и удалите невключенный TP, так как он затемнит воздействие геля на пленки.

Поместите гели в промаркированные контейнеры и накройте пятном кумаси на 15 минут. Далее удалите пятно от кумаси. Быстро смойте гели водой и добавьте раствор для задержания.

Задерживайте гели до тех пор, пока белки не станут хорошо заметны. Полоса для MVP и полоса для подложки должны быть видны для каждого образца. Чтобы высушить гели, отрежьте большой лист фильтровальной бумаги и положите его на сушилку.

Намочите целлофановый лист в дистиллированной воде, пока он не станет гладким и не сморщится, и положите его поверх бумаги. Выложите гели поверх целлофанового листа, отмечая порядок расположения гелей. Намочите второй лист целлофана и положите поверх гелей.

Раскатайте все пузыри для получения красивой однородной поверхности. Закройте заслонку, включите пылесос и вбивайте гели в течение трех часов при температуре 80 градусов Цельсия. Как только гели высохнут, подвергните их воздействию двойной эмульсионной авторадиографической пленки с использованием экрана для усиления сигнала.

Оберните кассету сарановой пленкой или полиэтиленовым пакетом и заклейте скотчем, чтобы защитить от замерзания, прежде чем хранить кассету при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь. На следующий день достаньте кассету из морозилки и дайте ей оттаять при комнатной температуре. Проявляйте пленку в темном помещении с помощью пленочного процессора в соответствии с инструкциями производителя.

Ниже приведены репрезентативные результаты скрининга 180 киназ с использованием пептидного субстрата, меченного GST, соответствующего аминокислотам с 268 по 283 из регулятивного транскрипционного коактиватора kreb 2 или C RTC 2, а также с использованием классического субстрата киназного анализа основного белка миелина или MBP только двух. Киназы маркируют два, а высокородственная киназа маркирует три фосфорилированных. Двухпептидный MBP CRTC включен в качестве внутреннего контроля во все анализы, поскольку он содержит много фосфорильных остатков и работает со скоростью 18 килодальтон к дну геля.

Это позволяет интерпретировать специфику. Некоторые киназы надежно фосфорилируют субстрат и ПМК. Следует отметить, что скважины, содержащие только GST, всегда очищают некоторую эндогенную киназную активность.

Таким образом, в анализе всегда присутствует фоновое фосфорилирование. Хотя это не исключает того, что фосфорилирование субстрата является реальным, это предполагает, что в условиях in vitro киназа может быть менее селективной. Особенно информативным является включение нескольких субстратов с различной молекулярной массой, чтобы сделать выводы о специфичности киназного субстрата.

Поскольку скрининг проводится in vitro, а дополнительные уровни сложности возникают in vivo, кандидат в киназы должен быть валидирован в клетках. Например, киназа-кандидат может обладать способностью фосфорилировать субстрат in vitro, она не может экспрессироваться в том же типе клеток или в тех же субклетках компартмента, что и субстрат. Обычно это делается с помощью РНК-опосредованного сайленсинга кандидата.

Также возможно проведение вторичного скрининга с использованием нефосфорил-родственного мутанта субстрата для подтверждения специфичности.