Строительство Клеточная нейромедиатор Флуоресцентные Engineered Репортеры (CNiFERs) для оптического детектирования нейротрансмиттеров В Vivo

Общая цель этого видео — описать методологию создания и тестирования флуоресцентных репортеров на основе клеточных нейротрансмиттеров, или CNiFER, которые могут быть использованы для оптического мониторинга высвобождения конкретных нейротрансмиттеров in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, касающиеся времени и высвобождения нейромодуляторов в мозге. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть адаптирована для любого типа нейромедиатора или нейромодулятора, который сигнализирует через GPCS.

Региональная демонстрация этого метода полезна. Это инъекция in vivo, и последующая визуализация CNiFER технически сложна. Чтобы начать эту процедуру, посмотрите на клетки HEK293, которые содержат фронтальный детектор кальция и химерный G-белок в колбе T-25.

Затем выращивайте клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами CO2 до тех пор, пока не произойдет слияние примерно на 50%. После этого отсасывайте среду из колбы Т-25. Добавьте два миллилитра смеси вируса ленты и инкубируйте колбу Т-25 при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2.

На следующий день соберите зараженные клетки HEK293, добавив один миллилитр трипсина. Далее ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах питательной среды HEK293. Засейте один миллилитр клеток в колбу Т-75 для заморозки и хранения, а 1,5 миллилитра клеток в колбу Т-25 для анализа FACS.

Для 10-точечной кривой агонистов, чтобы проверить инфицированные клетки, засейте первые два ряда фибронектина, покрытого 96-луночным планшетом, 100 микролитрами клеточной суспензии на лунку. Затем инкубируйте клетки HEK293, растущие в колбе Т-25, колбе Т-75 и планшете на 96 лунок до тех пор, пока примерно 90% не слияются при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение одного-двух дней. Перед анализом FACS определите функциональную экспрессию GPCR, подготовив планшет для лекарственного препарата с 10 различными концентрациями агонистов, которые выходят за скобки прогнозируемого EC 50.

Приготовьте различные концентрации агониста с помощью метода серийного разведения и создайте шаблон, чтобы отслеживать концентрации препарата. Далее установите температуру считывателя пластин на 37 градусов по Цельсию. Затем запрограммируйте 96-луночный считыватель флуориметрических пластин для измерения ладов и выполнения переноса раствора.

Для измерения ладов с помощью генетически закодированного датчика кальция на основе ладов, TNXXL, установите длину волны возбуждения на уровне 436 плюс-минус 4,5 нанометров. Затем установите фильтры излучения и фильтры отсечки для ECFP и цитринов. Затем запрограммируйте считыватель пластин на измерение выбросов каждые четыре секунды, в общей сложности 180 секунд.

Выбирайте варианты для объема пластины 100 микролидеров, высоты пипетки 150 микролитров и подачи 50 микролитров препарата из трехкратной составной пластины. Установите временную точку для доставки лекарства в 30 секунд. После этого отсасывайте среду из рядов А и В, и добавляйте 100 микролитров ACSF в 96-луночный нюхатель, то есть около 90% конфлюента.

Затем загрузите тройную пластину для лекарств и 96-луночную нюхательную пластину в считыватель пластин. Подождите 30 минут, чтобы уравновесить пластины при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем начинать программу. После запуска считывателя пластин экспортируйте значения флуоресцентного считывателя в текстовый файл.

Затем импортируйте этот файл в ранее созданный шаблон электронной таблицы, который нормализует интенсивность цветения до базовых линий стимула, вычисляет отношение пиковых ладов для каждой концентрации агониста и генерирует кривую реакции на дозу. Подготовьте пипетку для инъекций CNiFER, поместив стеклянный капилляр на вертикальный электродный съемник. С помощью щипцов сломайте кончик электрода диаметром примерно 40 микрометров.

Поместите смоченную губку ACSF на предварительно сформированное окно черепа мыши, находящейся под наркозом, толщиной два на три миллиметра, чтобы сохранить влагу во время подготовки клеток к инъекции. Затем соберите клон CNiFER, выращенный в колбе Т-75, примерно до 80% конфлюенции. Аспирируйте среду, и промойте клетки стерильным PBS.

Удалите PBS и используйте 10 миллилитров ACFS, чтобы выбить клетки со дна колбы. Затем тритхерите клетки, чтобы диссоциировать клеточные скопления. Центрифугируйте в течение двух минут в центрифуге для клеточных культур.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах ACSF. Затем центрифугируйте в течение 30 секунд при 1400 умноженных на G и удалите надосадочную жидкость, оставив гранулу, покрытую ACSF. После этого снова наполните инъекционную пипетку минеральным маслом.

Загрузите пипетку в наноинъектор. Нанесите пять микролитров клеточной суспензии CNiFER на полоску пластиковой парафиновой пленки возле мышиного препарата. Втяните элементы CNiFER в вытянутую пипетку.

Теперь переместите пипетку в целевые координаты x и y. Опустите пипетки, и проткните истонченный череп, подготовленный ранее. Продолжайте движение на глубине от 200 до 400 микрометров ниже поверхности черепа, во втором и третьем слоях коры.

Введите 4,6 нанолитра клеток CNiFER в самое глубокое место с помощью нано-инжектора. Обратите внимание на движение на границе раздела масла и ячейки. А затем подождите пять минут, пока ячейки разойдутся.

Извлеките из пипетки примерно 100 микрометров и введите еще 4,6 нанолитра клеток CNiFER и снова подождите пять минут. После этого медленно и осторожно извлеките пипетку, чтобы предотвратить обратный поток CNiFER. В этой процедуре поместите платформу визуализации с ограниченным головой мышью под объектив для 10-кратного погружения в воду в двухфотонном микроскопе.

Вставьте фильтрующий куб для визуализации ладов, который имеет дихроичное зеркало на 505 нанометров и полосовые фильтры с диапазонами от 460 до 500 нанометров для измерения ECFP и от 520 до 560 нанометров для измерения цитрина. Затем добавьте ACSF в колодец, содержащий утонченное окно черепа, и опустите 10-кратный объектив погружения в воду в ACSF. Используйте окуляр в сочетании с ртутной лампой и кубом фильтра GFP для определения местоположения CNiFER.

Теперь переключитесь на цель 40-кратного погружения в воду. Затем выберите подходящий световой путь для двухфотонной визуализации. Включите фемтосекундный импульсный лазер ближнего инфракрасного диапазона.

Выберите длину волны 820 нанометров и настройку мощности от пяти до 15%Установите напряжение pmt one и pmt two на субмаксимальное значение, обычно 500-1000 вольт, в зависимости от pmt. Затем установите коэффициент усиления равным единице для каждого канала и обнулите положение z для цели. Опустите объектив примерно на 100-200 микрометров от поверхности коры головного мозга и начните сканирование xy.

Регулируйте мощность лазера, коэффициент усиления и напряжение фэу для каждого канала, чтобы оптимизировать соотношение сигнал/шум цветения CNiFER. Затем используйте программное обеспечение, чтобы ограничить визуализацию областью, содержащей ячейки CNiFER, а также фоновой областью. Выберите пастушью линию, усредняя за два, для подходящего соотношения сигнал/шум, и используйте частоту сканирования от 3 до 1 герц при четырех микросекундах на пиксель.

После этого нарисуйте ROI вокруг ячеек CNiFER. Окружает около трех-четырех ячеек в плоскости. Настройте анализ средней интенсивности ROI в режиме реального времени.

Затем начните сбор данных для мониторинга цветения CNiFER с течением времени и начните электрическую стимуляцию или поведенческий эксперимент, одновременно наблюдая за ладами. В этом примере отклик лада D2R CNiFER измерялся на считывателе пластин с системой подачи раствора. На этом графике показана реакция ладов во время применения дофамина к D2 CNiFERs.

Обратите внимание, что эмиссия ECFP снижается, в то время как эмиссия цитринов увеличивается с дофамином. А вот график соответствующего соотношения ладов. Здесь показаны кривые реакции на дозу для ответа D2 CNiFERs на дофамин и норадреналин.

Кроме того, представлено отзывчивое управление CNiFER, не имеющее D2R. Эта гистограмма показывает реакцию на отношение ладов для других нейротрансмиттеров и модуляторов на 50 наномолярах и одном микромоляре. В данном случае электрическая стимуляция нейронов DA в черной субстанции вызывает значительное изменение отношения ладов для D2 CNiFER.

Обратите внимание, как амплитуда ответа увеличивается с увеличением интенсивности электрической стимуляции. Сочетание стимуляции с инъекцией кокаина усиливает реакцию CNiFER. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создавать, тестировать и использовать CNiFER для визуализации in vivo.

На протяжении всей разработки CNiFER важно поддерживать стерильную технику, потому что эти клетки в конечном итоге будут имплантированы живым мышам. Реализация CNiFERs предоставляет важный инструмент для исследований в области нейробиологии для оптического измерения высвобождения любого нейромедиатора или нейромодулятора, который сигнализирует через рецептор, сопряженный с G-белком. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.