Строительство Клеточная нейромедиатор Флуоресцентные Engineered Репортеры (CNiFERs) для оптического детектирования нейротрансмиттеров

Общая цель данного видео — описать методику создания и тестирования клеточных флуоресцентных репортеров нейромедиаторов (CNiFERs), которые могут быть использованы для оптического мониторинга высвобождения специфических нейромедиаторов in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, касающиеся времени и процесса высвобождения нейромодуляторов в головном мозге. Основным преимуществом данной техники является то, что она может быть адаптирована для любого типа нейромедиатора или нейромодулятора, передающего сигнал через GPCS.

Региональная демонстрация данного метода весьма полезна. Инъекция CNiFERs in vivo и последующая визуализация технически сложны. Для начала данной процедуры используйте клетки HEK293, содержащие кальциевый детектор на основе FRET и химерный G-белок, в колбе T-25.

Затем культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения примерно 50% конфлюэнтности. После этого аспирируйте среду из флакона T-25. Добавьте 2 мл смеси среды с лентивирусом и инкубируйте флакон T-25 при 37 °C и 5% CO2.

На следующий день соберите инфицированные клетки HEK293, добавив 1 мл трипсина. Затем ресуспендируйте осадок клеток в 5 мл ростовой среды для HEK293. Перенесите 1 мл суспензии клеток во флакон T-75 для замораживания и хранения, а 1,5 мл клеток — во флакон T-25 для анализа методом FACS.

Для построения кривой зависимости эффекта от концентрации агониста по 10 точкам с целью тестирования инфицированных клеток, внесите в первые два ряда планшета на 96 лунок с фибронектиновым покрытием по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку. Затем инкубируйте клетки HEK293, растущие в колбах T-25, T-75 и планшете на 96 лунок, до достижения примерно 90% конфлюэнтности при 37 °C с 5% CO2 в течение одного-двух дней. Перед проведением FACS-анализа определите функциональную экспрессию GPCR, подготовив планшет с 10 различными концентрациями агониста, охватывающими предполагаемое значение EC 50.

Подготовьте различные концентрации агониста методом серийного разведения и создайте шаблон для учета концентраций препарата. Затем установите температуру планшетного ридера на 37 °C. После этого запрограммируйте флуориметрический планшетный ридер на 96 лунок для измерения FRET и осуществления переноса растворов.

Для измерения FRET с помощью генетически кодируемого кальциевого сенсора на основе FRET, TNXXL, установите длину волны возбуждения на 436 ± 4,5 нм. Затем установите эмиссионные фильтры и отсекающие фильтры для ECFP и цитрина. Далее запрограммируйте планшетный ридер на измерение эмиссии каждые четыре секунды в течение общего времени 180 секунд.

Выберите параметры для объема планшета 100 мкл, высоты 150-мкл пипетки и подачи 50 мкл препарата из трехлуночного планшета с соединениями. Установите временную точку подачи препарата на 30 секунд. После этого аспирируйте среду из рядов A и B и добавьте 100 мкл ACSF в 96-луночный планшет-сниффер, имеющий примерно 90% конфлюэнтность.

Затем поместите планшет с трехкратной дозировкой препарата и 96-луночный планшет-детектор в планшетный ридер. Перед запуском программы дайте планшетам стабилизироваться при температуре 37 °C в течение 30 минут. По завершении работы планшетного ридера экспортируйте значения флуоресценции в текстовый файл.

Затем импортируйте этот файл в ранее созданный шаблон электронной таблицы, который нормализует интенсивность флуоресценции по базовым линиям до стимуляции, вычисляет пиковое отношение FRET для каждой концентрации агониста и строит кривую зависимости «доза-ответ». Подготовьте инъекционную пипетку CNiFER, установив стеклянный капилляр в вертикальный прибор для вытяжки электродов. С помощью пинцета обломайте кончик электрода до достижения диаметра примерно 40 мкм.

Поместите смоченную в ACSF губку на предварительно сформированное тонкое окно в черепе размером 2х3 мм анестезированной мыши, чтобы поддерживать увлажнение в процессе подготовки клеток к инъекции. Затем соберите клон CNiFER, выращенный в колбе T-75 до примерно 80% конфлюэнтности. Отсосите среду и промойте клетки стерильным PBS.

Удалите PBS и используйте 10 миллилитров ACFS, чтобы отделить клетки от дна колбы. Затем проведите тритурацию клеток для диссоциации клеточных агрегатов. Центрифугируйте в течение двух минут в центрифуге для культур клеток.

Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 µL ACSF. Затем центрифугируйте в течение 30 секунд при 1400 ×g и удалите супернатант, оставив осадок, покрытый ACSF. После этого заполните инъекционную пипетку минеральным маслом в обратном направлении.

Установите пипетку в наноинжектор. Нанесите 5 µL суспензии клеток CNiFER на полоску пластиковой парафиновой пленки рядом с препаратом мыши. Наберите клетки CNiFER в вытянутую пипетку.

Теперь переместите пипетку в заданные координаты x и y. Опустите пипетки и проколите истонченную черепную кость, подготовленную ранее. Продолжайте движение примерно на 200–400 мкм ниже поверхности черепа, в второй и третий слои коры.

Введите 4,6 nanoliters клеток CNiFER в самую глубокую точку с помощью наноинъектора. Обратите внимание на движение на границе раздела масла и клеток. Затем подождите пять минут, пока клетки распределятся.

Отодвиньте пипетку примерно на 100 micrometers и введите еще 4.6 nanoliters клеток CNiFER, затем снова подождите пять минут. После этого медленно и осторожно извлеките пипетку, чтобы предотвратить обратный ток клеток CNiFER. В ходе данной процедуры поместите платформу для визуализации с зафиксированной головой мыши под 10x объектив с иммерсией в воду двухфотонного микроскопа.

Вставьте фильтр-куб для FRET-визуализации, который содержит дихроичное зеркало на 505 нм и полосовые фильтры в диапазоне от 460 нм до 500 нм для измерения ECFP и от 520 нм до 560 нм для измерения citrine. Затем добавьте ACSF в лунку с истонченным окном черепа и погрузите 10-кратный объектив с водным погружением в ACSF. Используйте окуляр совместно с ртутной лампой и GFP-фильтром для поиска CNiFERs.

Теперь переключитесь на объектив с водной иммерсией 40x. Затем выберите соответствующий путь луча для двухфотонной визуализации. Включите ближний инфракрасный фемтосекундный импульсный лазер.

Выберите длину волны 820 нанометров и установите мощность в диапазоне от 5 до 15%. Установите напряжение ФЭУ-1 и ФЭУ-2 на субмаксимальный уровень, обычно 500-1000 вольт, в зависимости от ФЭУ. Затем установите коэффициент усиления (gain) равным единице для каждого канала и обнулите положение z объектива. Опустите объектив примерно на 100-200 микрометров от поверхности коры и запустите сканирование по осям xy.

Отрегулируйте мощность лазера, усиление и напряжение ФЭУ для каждого канала, чтобы оптимизировать соотношение сигнал/шум флуоресценции CNiFER. Затем с помощью программного обеспечения ограничьте область визуализации регионом, содержащим клетки CNiFER, а также регионом фона. Выберите линию сканирования (cowman line) с усреднением по двум значениям для достижения подходящего соотношения сигнал/шум и используйте скорость сканирования от 3 до 1 Гц при 4 мкс на пиксель.

После этого выделите область интереса (ROI) вокруг клеток CNiFER, охватывая примерно три-четыре клетки на плоскость. Настройте анализ средних интенсивностей ROI в режиме реального времени.

Затем запустите сбор данных для мониторинга флуоресценции CNiFER во времени и начните электрическую стимуляцию или поведенческий эксперимент, отслеживая значение FRET. В данном примере ответ FRET D2R CNiFER измеряли на планшетном ридере с системой подачи растворов. На этом графике показан ответ FRET при воздействии дофамина на D2 CNiFER.

Обратите внимание, что при воздействии дофамина интенсивность излучения ECFP снижается, в то время как интенсивность излучения цитрина увеличивается. Здесь представлен график соответствующего коэффициента FRET. На данном рисунке показаны кривые зависимости «доза-ответ» для реакции D2 CNiFERs на дофамин и норэпинефрин.

Кроме того, представлены отзывчивые контрольные CNiFER, не содержащие D2R. На этой столбчатой диаграмме показан ответ отношения FRET на другие нейромедиаторы и модуляторы в концентрациях 50 нМ и 1 мкМ. Здесь электрическая стимуляция дофаминергических нейронов в черной субстанции вызывает значительное изменение отношения FRET для D2 CNiFER.

Обратите внимание, что амплитуда ответа увеличивается при повышении интенсивности электрической стимуляции. Сочетание стимуляции с инъекцией кокаина усиливает ответ CNiFER. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как создавать, тестировать и использовать CNiFER для визуализации in vivo.

На протяжении всего процесса создания CNiFERs крайне важно соблюдать технику стерильности, так как эти клетки в конечном итоге будут имплантированы в живых мышей. Создание CNiFERs предоставляет исследователям в области нейробиологии важный инструмент для оптического измерения высвобождения любого нейромедиатора или нейромодулятора, который передает сигнал через G-белоксопряженный рецептор. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.