Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Мы демонстрируем метод пересадки культивируемых клеток в определенные участки ранних эмбрионов мышей для определения их потенциала in vivo. Мы также внедряем оптимизированный метод электропорации, в котором используются стеклянные капилляры известного диаметра, что позволяет точно доставлять экзогенную ДНК в несколько клеток эмбрионов.

Общая цель этих процедур — продемонстрировать, как точно переносить клетки или ДНК в эмбрионы мышей на ранних этапах постимплантации. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как проверка in vivo потенциала культивируемых клеток in vitro и функций определенных генов на определенных эмбриональных стадиях. Основные преимущества этих методик заключаются в том, что они не требуют какого-либо специализированного оборудования и делают возможными экспериментальные манипуляции по раннему постановке плантационного мышиного мшанки После принесения в жертву беременной самки на день Е 7,5 или Е 8,5 согласно текстовому протоколу, с помощью ножниц и щипцов изолируют матку и помещают ее в 30-миллиметровую тарелку, наполненную М двумя средними двумя парами тонких щипцов.

Осторожно разорвите миометрий, затем снимите децидуа, стараясь не проколоть лишние эмбриональные полости. Удалите мембрану райкера с помощью щипцов, чтобы зажать ее и медленно отделить от эмбриона. Затем под стерео препарирующим микроскопом проверьте эмбрионы, чтобы убедиться, что желточный мешок амнион и операционный плацентарный конус не повреждены С помощью пипетки переложите эмбрионы в чистую чашку М два и поместите на 30-миллиметровую пластиковую крышку чашки Петри на лед или ледяную платформу, чтобы частично охладить эмбрионы.

Готовят питательную среду и культивируют эмбрионы в соответствии с текстовым протоколом для прививки культивируемых клеток в эмбрионы мышей. Начните с использования наконечника для пипетки объемом 200 микролитров для физического соскабливания эбластовых стволовых клеток, которые повсеместно экспрессируют GFP из шестилуночного планшета. Перенесите клетки в чашку с эмбрионами.

Прикрепите вытянутый вручную трансплантационный капилляр к аспираторной трубке, чтобы сделать ротовую пипетку осторожно всасывающей пипеткой, чтобы втянуть один или несколько скоплений клеток более 20 клеток в капилляр для трансплантации. Затем аккуратно продуйте ячейки, чтобы разогнать крупные комки. Выберите один комок, содержащий от 10 до 20 клеток, и втяните его в капилляр для прививки.

Опять же, удерживая комок близко к отверстию капилляра с помощью щипцов. Свободно удерживайте эмбрион на месте и вставьте капилляр для прививки в интересующую область. Чтобы создать проем.

Аккуратно изгоните комок из капилляра для прививки, оставив короткую цепочку из 10-20 клеток, застрявших в эмбрионе. Оставьте эмбрионы в одной и той же чашке с М двумя средами и используйте флуоресцентный состав, препарирующий микроскоп и камеру для визуализации привитых эмбрионов. Сведите время визуализации к минимуму, чтобы избежать воздействия чрезмерного света и тепла на эмбрионы.

Сразу после визуализации с помощью пасты перенесите эмбрионы с минимальным объемом М-2 в предварительно уравновешенную культуральную среду и культуру в соответствии с указаниями в текстовом протоколе перед проведением экспериментов по электропорации используйте горизонтальную полярную микропипетку для извлечения пипеток для инъекций ДНК с тонким наконечником и отверстием менее 10 микрометров. Для стеклянной капиллярной электропорации используйте микрокузницу, чтобы вырезать отверстие пипеток для инъекций ДНК до внутреннего диаметра 20 или 30 микрометров с чистым наконечником и без сломанных краев. Прикрепите каждый платиновый электрод к тонкому изолированному проводу и вставьте его в держатель иглы для микроинъекций, покрытый изоляционной лентой.

Для приготовления капиллярного электрода ручной работы вставьте платиновую проволоку диаметром 0,2 миллиметра в стеклянный капилляр электропорации с фиксированным отверстием диаметром 20 или 30 микрометров. Сфокусировать электрический ток и доставить плазменную ДНК в небольшую интересующую область эмбриона. Чтобы сделать L-образный электрод, согните платиновую проволоку диаметром 0,2 миллиметра, создав L-образную форму с горизонтальной частью L-образной формы длиной около одного миллиметра.

Установите иглодержатели на стандартные держатели инструментов для микроманипуляций. Подключите капиллярный электрод к аноду блока питания. Подсоедините Г-образный электрод к аноду мультиметра.

Затем подключите катод мультиметра к катоду блока питания. Заполните стеклянный капилляр электропорации PBS с точностью до одного-двух миллиметров от верхней части и вставьте прямой платиновый электрод в стеклянный капилляр, пока он не достигнет дна капилляра. Закрепите L-образный электрод на поверхности 30-миллиметровой чашки Петри, заполненной PBS.

Используйте пневматический пиконасос для инъекции ДНК. Введите инъекционную иглу из бокового эбласта в амниотическую полость эмбриона и введите примерно пять микролитров раствора ДНК в полость или до ее полного заполнения. Следите за тем, чтобы эмбрион не лопнул.

Затем осторожно расположите эмбрион между электродами и переместите капиллярный электрод точно в то место, куда должна быть доставлена ДНК. Используя напряжение 200 вольт в шести импульсах продолжительностью 50 миллисекунд каждый, эмбрион подвергался электропорации с интервалом в одну секунду между каждым импульсом. Немедленно перенесите эмбрион в предварительно уравновешенную питательную среду перед повторением электропорации для следующего эмбриона.

Обнаруживайте электропорированные живые или мертвые клетки через два часа после электропорации. Согласно приведенному здесь текстовому протоколу, эмбрион с эпи-ПСК повсеместно экспрессирует EGFP, привитый на E 7.5 и культивируемый ex vivo в течение 24 часов. Когда от 10 до 16 fsc были привиты эмбрионам E 7.5, они хорошо ингенерировались и пролиферировались в эмбрионе-хозяине.

Тем не менее, прививка большего количества клеток не приводит к лучшему химеризму и фактически приводит к образованию неинкорпорированных скоплений, как показано здесь. Как показано при этом электропорация GFP, экспрессирующих плазмиды. GFP-положительные клетки были обнаружены через один-два часа после электропорации.

Когда дистальные эбластные клетки в поздней стадии примитивной полосы эмбриона были подвергнуты электропорации, меченые клетки внесли свой вклад в нервную дерму через 24 часа в культуре, что соответствует известным картам судьбы эбластных клеток в эмбрионах гастро-стадии. На этом рисунке показано, что, как и при использовании других типов электродов для электропорации, капиллярный электрод также вызывал некоторую степень гибели клеток в целевой области. Поскольку эта область оказалась более темной по цвету по сравнению с соседними областями, помечающими ядра мертвых клеток мембраной, непроницаемой для дальнего красного флуоресценции умирают.

Подтверждено, что метод капиллярной электропорации приводит лишь к небольшому количеству мертвых клеток вблизи места электропорации. При попытке выполнить эти процедуры важно начать культивирование эмбрионов в течение двух часов. После выделения матки от мышей в конце культивирования эмбрионы могут быть зафиксированы.

Другие методы, такие как секционное окрашивание, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как вклад донора или электроплетеных клеток в эмбрионы хозяина. После просмотра этого видео у нас должно быть хорошее понимание того, как точно переносить клетки нашей ДНК в эмбрионы мышей на ранних этапах постимплантации.