Тюнинг параллельного Колонка сегментированные потока и включение мультиплексированных обнаружения

Общая цель данной процедуры ВЭЖХ заключается в настройке колонки с параллельным сегментированным потоком для обеспечения мультиплексного детектирования. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области здравоохранения, наук об окружающей среде, криминалистики, а также в любых областях, требующих анализа сложных образцов, таких как биопоиск. Данная методика позволяет проводить комплексный анализ образцов, одновременно предоставляя информацию о химических и биоактивных свойствах веществ в сложных смесях.

Протоколы мультидетекции также позволяют проводить экспресс-анализ. Данный метод дает возможность разрабатывать стратегии определения химического профиля сложных смесей, таких как кофе и вино, что позволяет производителям отличать свою продукцию от дешевых контрафактных разновидностей. На первый взгляд может показаться необычным решение не направлять весь образец на один детектор для проведения точного анализа.

Однако концентрация аналита в каждом потоке выше, чем в общем потоке традиционной колонки. Для начала подготовьте систему ВЭЖХ, используя 100% деионизированную воду и чистый метанол в качестве подвижных фаз А и B соответственно. При использовании масс-спектрометрического детектора добавьте 0,1% муравьиной кислоты в обе подвижные фазы, затем промойте насосы ВЭЖХ в соответствии с инструкциями производителя.

Соберите детекторы MS UV VS и DPPH в соответствии с инструкциями производителя. Убедитесь, что компоненты расположены надлежащим образом, чтобы мертвый объем в линиях детекторов был минимальным.

Затем установите длину волны детектора UV VISTA, соответствующую данному образцу. Для масс-спектрометрического детектора установите 280 nanometers. Для анализа общего ионного тока (TIC) используйте положительный режим с методом детектирования полного сканирования.

Установите температуру и поток газа масс-спектрометрического (МС) детектора на следующие значения: температура испарителя — 500 °C, температура капилляра — 350 °C, поток вспомогательного газа — 40 единиц, поток продувочного газа — 5 единиц, скорость потока обечайки — 60 единиц и напряжение распыления — 3,5 кВ. Для приготовления реагента с радикалом DPPH растворите 25 мг DPPH в 250 мл метанола в мерной колбе.

Добавьте 250 µL муравьиной кислоты в раствор и подвергните его ультразвуковой обработке в течение 10 минут. Затем накройте колбу фольгой для защиты от воздействия света. Далее, промойте помпу раствором радикалов DPPH в соответствии с рекомендациями производителя для настройки системы определения радикалов DPPH.

Убедитесь, что линия насоса закреплена на входе Т-образного соединителя, после чего подсоедините реакционную спираль объемом 100 µL к выходу Т-образного соединителя. Подключите детектор к другому концу корпуса реакционной спирали ENC, саму реакционную спираль и нагреватель колонки. В завершение настройте УФ-детектор радикалов DPPH на длину волны 520 nm.

Для сборки колонки с параллельным сегментированным потоком (PSF) сначала подсоедините вход колонки к прибору ВЭЖХ. Затем с помощью отрезка трубки соедините центральный порт с масс-детектором. Используя трубки того же размера, подсоедините один периферийный порт колонки к УФ-детектору (UV VS), а другой — к Т-образному соединителю системы детектирования радикалов DPPH.

Заблокируйте все неиспользуемые периферийные порты с помощью заглушек для колонок. Установите скорость потока ВЭЖХ на 1 mL в минуту 100% подвижной фазы B для колонки с внутренним диаметром 4.6 mm и длиной 250 mm. Проводите уравновешивание в течение 20 минут.

Для начала настройки системы PSF сначала слейте жидкость в пустые приемные сосуды. Используйте эти флаконы для раздельного сбора подвижной фазы из портов УФ-детектора и DPPH-радикалов. Зафиксируйте время сбора и соберите в каждый сосуд не менее 500 мг растворителя.

Затем взвесьте емкости для сбора, чтобы определить массу подвижной фазы, и разделите массу на плотность метанола, чтобы вычислить объем подвижной фазы, собранной из каждого порта. Наконец, определите скорость потока на детектор МС и рассчитайте доли потока для всех детекторов в процентах от общего потока, как описано в текстовом протоколе. Если доли потоков существенно отклоняются от идеальных значений, при необходимости добавьте дополнительные трубки для регулировки противодавления и повторите процесс сбора и расчета.

Наконец, установите скорость потока насоса с реагентом DPPH-радикала так, чтобы она соответствовала скорости потока выходного порта, подключенного к детектору. Был проведен мультиплексный анализ образца кофе методом ВЭЖХ. Возможность одновременной записи УФ-хроматограмм и масс-хроматограмм DPPH-радикала позволяет легко соотнести соединения в образце, проявившие положительный отклик на DPPH-радикал, с соответствующими УФ-пиками.

При анализе масс-спектрометрических ответов на основе выравнивания времени удерживания, в случаях обнаружения положительного отклика детектором MSS TIC, регистрировалась молекулярная масса пика. Простота сопоставления пиков между различными процессами детектирования позволяет проводить быстрый и более эффективный скрининг и характеристику сложных образцов, таких как кофе. После освоения данной методики ее настройка занимает около часа, после чего система готова к анализу образцов согласно данной процедуре. Для получения дополнительной информации об образце могут быть использованы другие детекторы, такие как детекторы показателя преломления и флуоресценции, а также методы химического детектирования, например, хемолюминесценция.

После просмотра этого видео вы должны осознать важность мультиплексного детектирования для более глубокого понимания состава сложного образца. Кроме того, мультиплексное детектирование с использованием параллельных колонок с сегментированным потоком является чрезвычайно эффективным способом проведения биоразведки.