Сообщение Колонка дериватизации с использованием реакции потока высокоэффективной жидкостной хроматографии Колонки
26 апреля 2016 г.
Представлен протокол использования высокопроизводительных жидкостных хроматографических колонок реакционного потока для методов, использующих дериватизацию после колонки (PCD).
Общая цель данного метода заключается в повышении эффективности и чувствительности высокоэффективной жидкостной хроматографии с постколоночной дериватизацией (метод PCD) за счет использования реакционной проточной колонки. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в таких областях, как фармацевтика, биомедицина и экология, где анализируются соединения с низким откликом на детекторах ВЭЖХ. Основным преимуществом данной методики является отсутствие необходимости в использовании реакционных змеевиков.
Поскольку смешивание элюата колонки с дериватизирующим реагентом происходит более эффективно, чем при использовании традиционных методов, данный подход применялся для изучения антиоксидантов, аминокислот и фенолов. Он также может быть применен к другим классам соединений, таким как тиолы, металлы, антибиотики и токсины.
Хотя дериватизация проводится не для всего образца, благодаря меньшему размыванию зоны концентрация аналита в потоке элюата выше, чем при традиционном постколоночном дериватизировании. Для начала данной процедуры подготовьте систему ВЭЖХ, используя в качестве подвижной фазы 100% воду в линии A и 100% метанол в линии B, промыв насосы в соответствии с требованиями производителя. Настройте компоненты системы ВЭЖХ и дополнительный насос для дериватизации.
После этого настройте УФ/ВИД-детектор для анализа на длине волны 520 нанометров. Подключите вход колонки потока реакции (RF) к прибору ВЭЖХ. Подключите периферийный выходной порт к УФ/ВИД-детектору, используя трубку длиной 15 сантиметров с внутренним диаметром 0,13 миллиметра.
Затем подсоедините линию насоса с DPPH к периферийному порту на выходе колонки RF. Закройте неиспользуемый периферийный порт на выходе колонки RF с помощью стоппера для колонки. Подсоедините отрезок трубки длиной 15 сантиметров с внутренним диаметром 0,13 миллиметра к центральному порту на выходе колонки RF.
Установите скорость потока насоса ВЭЖХ на 1 мм/мин при использовании 100% метанола. Затем уравновесьте колонку 100% метанолом в течение 10 минут. В это время приготовьте раствор DPPH в метаноле с концентрацией 0,1 мг/мл.
Обработайте колбу с реагентом DPPH ультразвуком в течение 10 минут. Промойте насос DPPH подготовленным реагентом DPPH в соответствии с требованиями производителя. После этого возьмите две сухие и чистые емкости, пометьте одну из них как «центральная», а другую — как «периферическая». Точно взвесьте обе емкости.
Соберите элюат, выходящий из центрального порта, в сосуд с пометкой «central» в течение одной минуты. После повторного взвешивания сосуда центрального порта вычислите массу потока из центрального порта. Повторите предыдущие шаги для элюата, выходящего из UV/VIS, который подключен к периферийному порту колонки RF.
Вычислите вес для сосуда периферического порта. Затем рассчитайте процентный вклад потока из центрального и периферического портов. Повторяйте предыдущие шаги до достижения правильного соотношения потоков, после чего установите скорость потока насоса DPPH на 0.5 milliliters per minute.
После завершения анализа остановите подачу потока реагента для дериватизации. Извлеките линию насоса с реагентом DPPH из периферийного порта и закройте порт пробкой. Уравновесьте колонку подвижной фазой, в которой она будет храниться, пропуская подвижную фазу через колонку со скоростью 1 мм/мин в течение 10 минут.
Затем остановите поток насоса пузырьковой фазы на приборе ВЭЖХ. В завершение замените реагент DPPH метанолом и промойте дополнительный насос. Здесь представлены две хроматограммы образца кофе ристретто, дериватизированного радикалом DPPH с использованием как стандартного ПСД, так и РЧ-ПСД оборудования.
Здесь приведены рассчитанные пределы количественного определения и обнаружения для каждой из аминокислот, проанализированных в режимах RF-PCD и стандартного PCD. Здесь представлена хроматограмма четырех аминокислот, проанализированных с использованием стандартного метода PCD, метода RF-PCD и потока без дериватизации в методе RF-PCD. Здесь показано сравнение сигналов, полученных для пиков глицина и лейцина с использованием как стандартного метода PCD, так и метода RF-PCD.
Здесь представлено сравнение ширины пика триптофана при анализе с использованием стандартного метода PCD, метода RF-PCD и анализа непроизводного потока методом RF-PCD. Тестовый образец, состоящий из 21 компонента, включая вещества, которые дают отклик на схему дериватизации, и те, которые его не дают, был подвергнут разделению, дериватизации и детектированию. Для сравнения та же смесь была разделена и детектирована без дериватизации.
Здесь представлено сравнение формы пика пара-крезола в случае с использованием дериватизации на колонке RF-PCD и без нее. После освоения данного метода его настройка занимает столько же времени, сколько и при обычном анализе с постколонной дериватизацией. При выполнении этой процедуры важно максимально точно соблюдать предписанные соотношения потоков.
После выполнения данной процедуры для анализа других соединений можно использовать иные реагенты для послеколоночной дериватизации, такие как ОФА, нингидрин или галогены. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как настраивать и оптимизировать реакционную проточную колонку.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол повышения эффективности и чувствительности послеколоночной дериватизации (ПКД) в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием реакционных проточных колонок. Этот метод особенно полезен при анализе соединений с низким откликом детекторов ВЭЖХ в различных областях науки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Фармацевтические науки
- Биомедицинские науки
- Экологические науки
Теоретические сведения
- Высокоэффективная жидкостная хроматография широко применяется для анализа соединений.
- Постколоночная дериватизация повышает чувствительность детектирования.
- Традиционные методы часто требуют использования реакционных змеевиков, чего удается избежать в данном методе.
- Обеспечивается эффективное смешивание элюента из колонки с реагентами.
Цель исследования
- Для повышения эффективности методов ВЭЖХ с фотодиодным детектором.
- Для анализа соединений с низким откликом детектора.
- Для получения данных о различных классах соединений.
Используемые методы
- Использование колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии с потоком реагентов.
- Методы постколоночной дериватизации.
- Анализ антиоксидантов, аминокислот и фенолов.
- Применение для анализа тиолов, металлов, антибиотиков и токсинов.
Основные результаты
- Повышение эффективности и чувствительности при детектировании соединений.
- Улучшение характеристик метода за счет исключения реакционных петель.
- Успешное применение для нескольких классов соединений.
- Получение новых данных о сложных биохимических взаимодействиях.
Выводы
- Метод с проточной колонкой для проведения реакции значительно улучшает ВЭЖХ с фотодиодной детекцией.
- Данная методика универсальна и применима в различных областях науки.
- Будущие исследования могут расширить сферу ее применения в других аналитических областях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Постколоночная дериватизация (ПКД) повышает чувствительность детектирования аналитов с низким откликом в фармацевтических и биомедицинских исследованиях, однако традиционные методы характеризуются уширением пиков из-за использования длинных реакционных катушек. Реакционный поток ПКД (RF-PCD) устраняет это ограничение, обеспечивая эффективное смешивание внутри колонки, что повышает эффективность разделения и отношение сигнал/шум. Данное усовершенствование обеспечивает надежное количественное определение таких соединений, как аминокислоты, антиоксиданты и фенолы, что напрямую влияет на чувствительность анализа в рабочих процессах на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает детектирование непроизводных аналитов из центрального порта, что позволяет параллельно мониторировать нативные и модифицированные формы для понимания механизмов процесса.
- Практическая ценность: исключает необходимость в реакционных змеевиках, уменьшая «мертвый объем» системы и сводя к минимуму размывание зон для сохранения хроматографического разрешения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Повышает отношение сигнал/шум для низкоконцентрированных соединений, улучшая пределы обнаружения в анализах на антиоксиданты, аминокислоты и фенолы.
- Практическая ценность: Используются стандартные компоненты ВЭЖХ с насосом для дериватизации, что обеспечивает простую интеграцию в существующие аналитические платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает анализ различных классов соединений, включая тиолы, металлы, антибиотики и токсины, что расширяет возможности применения в исследованиях по профилированию безопасности и метаболитов.
- Операционная ценность: сохраняет совместимость с УФ/ВИД-детектированием при 520 nm, что позволяет легко внедрить метод без необходимости приобретения нового оборудования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
RF-PCD вписывается в континуум поиска новых соединений, повышая надежность детектирования при скрининге на ранних этапах, когда чувствительное количественное определение биоактивных соединений служит основой для идентификации и приоритизации перспективных кандидатов.
- Поисковая биология: повышает достоверность обнаружения метаболитов и биомаркеров с низким откликом за счет увеличения аналитической чувствительности без потерь, связанных с неэффективностью дериватизации.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных и воспроизводимых результатов благодаря минимизации объема реакции и эффективному перемешиванию, что способствует высокопроизводительной оценке соединений.
- Аналитика: позволяет проводить прямое сравнение дериватизированных и недериватизированных потоков, обеспечивая внутренний контроль для валидации анализа и нормализации данных.
- Трансляционные исследования: облегчает непрерывный мониторинг аналитов от этапа поиска до доклинических исследований за счет сохранения целостности аналитов и точности их детектирования.
- Корпоративное повторное использование: использует существующую инфраструктуру HPLC с минимальным усложнением системы, способствуя межведомственной стандартизации и переносимости методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при обнаружении аналита за счет сокращения числа ложноотрицательных результатов, вызванных низкой чувствительностью, и улучшения четкости сигнала.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет устранения вариативности, связанной с подготовкой реакционной катушки и эффективностью смешивания.
- Стратегическая ценность: Способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») при оптимизации соединений-лидеров за счет получения более точных данных о взаимосвязи «структура — активность» благодаря высокочувствительному детектированию.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение кандидатов с учетом рисков за счет повышения качества данных в первичных анализах по скринингу ADME и токсичности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке методов ВЭЖХ и оптимизации скорости потока для балансировки потоков реагента для дериватизации и подвижной фазы.
- Необходим специализированный насос для дериватизации и совместимая трубка (внутренний диаметр 0,13 mm) для точной подачи реагента в периферийные порты.
- Требуется стандартизация соотношений потоков между центральными и периферийными портами для обеспечения стабильной эффективности дериватизации в разных циклах анализа.
- Подразумевается регулярное техническое обслуживание, такое как продувка и этапы уравновешивания, для предотвращения переноса реагентов и обеспечения стабильности колонки.
- Метод ограничен одно- или двухкомпонентными реакциями дериватизации, при которых оба реагента могут вводиться одновременно через периферийные порты.
