Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

Этот протокол демонстрирует поток растяжения пробирного простой, надежный и высокая пропускная способность одной молекулы для изучения одномерный (1D) диффузии молекул вдоль ДНК.

Общая цель этой процедуры заключается в создании простого, надежного и высокопроизводительного анализа растяжения потока одной молекулы для изучения транспорта молекул вдоль ДНК. Это достигается путем предварительного получения меченой биотином лямбда-ДНК путем лигирования меченного биотином олиго в лямбда-ДНК. Вторым шагом является приготовление функционализированных покровных стеколей полиэтиленгликоля или ПЭГ в соответствии с протоколом одноэтапной реакции.

Затем создается проточная ячейка с высокой пропускной способностью путем сэндвича двусторонней ленты с предварительно вырезанными каналами между функционализированным покровным стеклом PEG и плитой из полидиметилсилоксана или PDMS, содержащей входные и выходные отверстия. Последним шагом является отслеживание траекторий отдельных флуоресцентных молекул в проточном канале с помощью покадровой визуализации полного внутреннего отражения или TIRF-визуализации. Для идентификации траекторий одиночных молекул, диффундирующих вдоль проточной растянутой лямбда-ДНК, используется надежное и эффективное специализированное программное обеспечение для отслеживания отдельных частиц для анализа необработанных флуоресцентных изображений.

Основными преимуществами такой конфигурации анализа по сравнению с альтернативами являются надежность подготовки покровного стекла, более высокая пропускная способность, сокращение ручного времени на подготовку образцов и более оптимизированный анализ данных без контроля. Демонстрировать процедуру будет постдок в моей лаборатории, доктор Кан Сюн. Перед началом этого анализа подготовьте все необходимые реактивы, как описано в тексте протокола.

Нагрейте 0,5 миллиграмма на миллилитр лямбда-ДНК до 65 градусов Цельсия в течение 60 секунд и сразу же погрузите во влажный лед. Смешайте 100 микролитров раствора лямбда-ДНК с двумя микролитрами 10 микромолярных олиго, меченных биотином, внутри микроцентрифужной пробирки. Нагрейте смесь до 65 градусов Цельсия в течение 60 секунд, а затем медленно охладите до комнатной температуры.

Выложите смесь на лед. Добавьте 11 микролитров реакционного буфера Т4 ДНК-лигазы и аккуратно перемешайте. Затем два микролитра, эквивалентные 800 единицам Т4 ДНК-лигазы и аккуратно перемешать.

Выдерживайте смесь в течение двух часов при температуре 16 градусов Цельсия или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Очистите продукт с помощью центробежных фильтрующих трубок с номинальным пределом молекулярной массы 100 килодальтон. Обработайте ультразвуком номер один в 95% этаноле в банке для окрашивания в течение 10 минут, а затем трижды прополощите ультрачистой водой.

Наполните баночку для окрашивания одним моляром гидроксида калия, снова обработайте ультразвуком в течение 10 минут, а затем трижды промойте ультрачистой водой. Повторите этот цикл дважды. Сушите покровные стекла под чистым потоком сухого газообразного азота.

Далее очистите и высушите покровные стекла, проведя воздушно-плазменную обработку под давлением 900 миллиторр в течение пяти минут. Инкубируйте покровные стекла с 50 микролитрами 25 мг на миллилитр силана-полиэтиленгликоля-биотина, растворенного в 95% этаноле при комнатной температуре в течение двух часов. Излишки полиэтиленгликоля смыть сверхчистой водой и высушить покровные стекла с полиэтиленгликолевым покрытием под чистым сухим потоком газообразного азота.

Спроектируйте проточные каналы с помощью программного обеспечения CAD и вырежьте каналы на двусторонней ленте с помощью ленточного резака. Удалите остатки ленты внутри каналов. Чтобы сделать плиты PDMS, тщательно перемешайте 45 грамм PDMS с пятью граммами сшитого реагента с помощью миксера.

Вылейте смесь в две 100-миллиметровые чашки Петри и оставьте посуду внутри вакуумной камеры примерно на 30 минут, пока не исчезнут все пузырьки воздуха. Оставьте посуду в духовке при температуре 80 градусов Цельсия примерно на два часа, пока PDMS не застынет. Вырежьте плиту PDMS, соответствующую размеру двустороннего скотча с предварительно вырезанными каналами.

Снимите одну защитную пленку с двустороннего скотча и приклейте к плоской стороне плиты PDMS. Пробивайте выходные и входные отверстия на пластине PDMS с помощью дырокола для биопсии с иглой 23 калибра. Снимите другую защитную пленку с двустороннего скотча и приклейте к функционализированной поверхности покровного стекла.

Закрепите собранную проточную ячейку на вкладыше предметного стекла микроскопа. Загрузите все предварительно дегазированные реагенты в резервуары, в которых трубка Tygon соединена с электромагнитным клапаном, а другая трубка подключена к трубке PEEK, что предотвратит обратный поток реагентов. Поток реагентов контролируется электромагнитными клапанами, которые управляются приложением для программирования скриптов.

Заправьте один канал потока путем протекания в пустом буфере. Вставьте три другие трубки PEEK во впускные отверстия. Будьте осторожны, чтобы не вызвать образование пузырьков воздуха внутри канала.

Подсоедините трубку Tygon с помощью короткой трубки PEEK от выпускного отверстия к контейнеру для отходов для проб. Влейте в 0,2 миллиграмм на миллилитр раствор стрептавидина и выдержите в течение пяти минут. Затем слейте в пустой буфер, чтобы вымыть несвязанный стрептавидин.

Влейте в один миллиграмм на миллилитр бычьего сывороточного раствора альбумина и выиграйте в течение одной минуты. Затем слейте в чистый буфер, чтобы смыть несвязанный бычий сывороточный альбумин. Влейте 100 пикомолярный раствор биотин-лямбда-ДНК и инкубируйте в течение 10 минут.

Затем слейте в пустой буфер, чтобы вымыть несвязанные лямбда-ДНК. Чтобы проверить качество функционализированного покровного стекла PEG, введите краситель для окрашивания ДНК, такой как оранжевый краситель SYTOX, и начните флуоресцентную визуализацию. Если качество покровного стекла хорошее, плотность растянутых лямбда-ДНК будет высокой.

Кроме того, настройте угол TIRF для достижения наивысшего соотношения сигнал/шум на изображениях почти полностью растянутых лямбда-ДНК с потоком. Чтобы отслеживать траектории одиночных молекул, начните инкубацию внутри нового канала, затем соедините субнаномолярные молекулы, меченные флуорофорами, с достаточно высокой скоростью потока с помощью шприцевого насоса и соберите покадровые флуоресцентные изображения с частотой кадров 100 Гц. Как правило, в одном поле зрения собирается 10 000 кадров, а фильмы — из нескольких полей зрения.

В конце снова добавьте краситель для окрашивания ДНК, чтобы подтвердить, что ДНК все еще может растягиваться по течению. Специальное программное обеспечение для отслеживания одиночных частиц будет использоваться для определения траекторий диффундирования одиночных молекул вдоль ДНК. Программное обеспечение сначала определит положения центроидов одиночных частиц с высокой точностью.

Удалите частицы, застрявшие на поверхности покровного стекла, а затем свяжите частицы в разных кадрах, чтобы сформировать траектории покадровой съемки. По этим траекториям будут оцениваться одномерные константы диффузии. Чтобы начать анализ данных, откройте приложение для программирования скриптов и перейдите в каталог программного обеспечения для отслеживания отдельных частиц.

Откройте скрипт с именем largedataprocess3.m. Одним из важных параметров, которые необходимо определить, является пороговое значение для обнаружения одиночных частиц. Чтобы определить оптимальное пороговое значение, запустите determine_threshold_value.

m script. Этот скрипт визуализирует, как пороговое значение влияет на обнаружение одиночных частиц. После определения оптимального порогового значения запустите процесс largedataprocess3.

m script. После завершения анализа слежения за отдельными частицами исходные траектории будут отфильтрованы с помощью запуска trajectory_filtering. m script.

Графический пользовательский интерфейс или графический пользовательский интерфейс создается для визуализации шага фильтрации. На панели графического интерфейса установите минимальное смещение вдоль ДНК, MinXDisp, равным двум пикселям. Установите максимальное поперечное смещение по отношению к DNA, MaxYDisp, равным двум пикселям.

Установите минимальное количество кадров, minFrames, равным 10. Установите минимальное количество состояний триплета, minTriplets, равным 10. Установите минимальную константу диффузии вдоль ДНК, D_par равной нулю.

Установите максимальную оценочную константу диффузии в поперечном направлении ДНК, D_trans, равной 10 мегапарам оснований в квадрате в секунду. Установите минимальный параметр статистики, Chi2 Stat, в значение минус пять. Установите минимальное отношение смещения вдоль ДНК к поперечному отношению к ДНК, MinX/Y, равным двум.

Все исходные траектории, которые проходят эти параметры фильтрации, будут перечислены в таблице 1, а те, которые не проходят, будут перечислены в таблице 3. Нажмите на номер траектории в первой таблице. Траектория будет отображена на графиках один и два.

Нажмите на кнопку воспроизведения, чтобы воспроизвести необработанные флуоресцентные изображения. Нажмите на кнопку «Добавить в таблицу2», если эта траектория является траекторией скольжения одной молекулы. В конечном итоге, все траектории, добавленные в table2, будут сохранены при закрытии графического интерфейса.

Траектории, прошедшие все этапы фильтрации, объединяются вместе, по которым будет оцениваться средняя константа диффузии. Чтобы вычислить средние константы диффузии, просто запустите скрипт calculate_mean_diffusion_constant.m. Эта процедура будет полезна многим людям, изучающим биофизику одиночных молекул in vitro.