Визуализация поверхностного привязанным Большой Молекулы ДНК с флуоресцентной ДНК связыванием белков пептид

Общая цель данной процедуры — создать удобную систему анализа ДНК для эпифлуоресцентного микроскопа, позволяющую манипулировать одиночными молекулами ДНК на модифицированных стеклянных поверхностях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области визуализации ДНК при изучении самой ДНК, а также ДНК-связывающих белков и других малых молекул.

Основным преимуществом данной методики является возможность с легкостью наблюдать за движущейся ДНК и анализировать ее. Для начала поместите стеклянные покровные стекла на стойку из ПТФЭ и закрепите их, используя фрагмент уплотнительной ленты из ПТФЭ. Обернув стекла, оставьте конец ленты длиной пять сантиметров, чтобы за него было удобно держать стойку во время процедуры очистки.

В вытяжном шкафу смешайте 350 миллилитров серной кислоты и 150 миллилитров перекиси водорода в стеклянном стакане объемом один литр для приготовления раствора «пиранья» для травления. Затем поместите кассету с покровными стеклами в раствор. Через два часа опорожните стакан и тщательно промойте покровные стекла деионизированной водой.

Продолжайте промывать покровные стекла до тех пор, пока pH воды в стакане не достигнет нейтрального значения. Затем подвергните штативы с покровными стеклами воздействию ультразвука в стакане с водой в течение 30 минут для очистки и подготовки стеклянных подложек. Слейте воду из стакана непосредственно перед аминосиланизацией. Для начала подготовьте раствор для аминосиланизации, добавив 2 мл алкоксисилана и 10 мл ледяной уксусной кислоты к 200 мл метилового спирта в чистом полипропиленовом контейнере.

Затем поместите чистые покровные стекла в раствор. Поместите очищенные покровные стекла в подготовленный раствор и встряхивайте их при комнатной температуре с частотой 100 rpm в течение 30 минут. Затем подвергните контейнер с модифицированными покровными стеклами ультразвуковой обработке в течение 15 минут при мощности 75 watts.

Затем снова встряхивайте их при комнатной температуре и 100 об/мин в течение как минимум 30 минут. По завершении слейте раствор из стакана и осторожно промойте покровные стекла три раза: один раз метиловым спиртом и дважды этиловым спиртом.

После окончательного промыва храните покровные стекла в этиловом спирте и используйте их в течение двух недель. Сначала приготовьте 10 миллилитров 0,1 молярного раствора бикарбоната натрия и профильтруйте его через шприцевой фильтр с порами 0,22 микрона. Затем растворите два миллиграмма биотин-ПЭГ-сукцинимидилкарбоната и 80 миллиграммов ПЭГ-сукцинимидилвалерата в 350 микролитрах профильтрованного раствора бикарбоната натрия.

Защитите раствор от света, используя светозащитную пробирку. Тщательно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 10 секунд, затем центрифугируйте её при 10 000 x g в течение одной минуты для удаления пузырьков воздуха. Затем промойте предметное стекло ацетоном, а после него — этиловым спиртом.

После промывки дайте предметному стеклу полностью высохнуть на воздухе. Нанесите каплю раствора ПЭГ объемом 50 µL на чистое предметное стекло. Медленно опустите аминилированное силаном покровное стекло на каплю под небольшим углом, чтобы под покровным стеклом не образовались пузырьки воздуха.

Затем поместите предметные стекла в горизонтальную, темную и увлажненную камеру минимум на три часа или на ночь при комнатной температуре. По окончании процедуры закройте оставшийся раствор PEG в защищенной от света пробирке и храните его при температуре четырех градусов Цельсия. После инкубации тщательно промойте ПЭГилированные покровные стекла деионизированной водой, а затем храните их в темном и сухом месте до использования.

Для создания проточной камеры наклейте полоски двустороннего клейкого скотча на акриловый держатель так, чтобы они были расположены перпендикулярно входным и выходным отверстиям и не перекрывали отверстия каналов. Затем, используя наконечник пипетки, прижмите скотч, чтобы герметизировать каналы. После этого поместите ПЭГилированное покровное стекло ПЭГилированной стороной вниз на верхнюю часть скотча для формирования проточных камер.

Чтобы предотвратить утечку раствора, прижмите верхнюю часть покровного стекла к области, где наклеена двусторонняя лента. Затем нанесите быстросохнущий эпоксидный клей по краям камер, чтобы зафиксировать их на месте. После этого подсоедините отрезок трубки длиной 2,5 сантиметра к газоплотному шприцу и герметизируйте соединение эпоксидным клеем.

Затем подсоедините длинную гибкую трубку к трубке, выходящей из шприца. Снова загерметизируйте соединение эпоксидным клеем. Заполните трубку, соединенную со шприцем, деионизированной водой, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха.

Затем вставьте трубку в отверстие проточной камеры, которое загерметизировано эпоксидным клеем. В другое отверстие установите наконечник дозатора на 200 µL, который будет служить резервуаром. Установите скорость потока шприцевого насоса на 50 µL/min.

Затем подайте в камеру 20 µL раствора белка авидина и выдержите его там в течение 10 минут. Далее наберите в шприц 20 µL биотинилированных олигодезоксинуклеотидов. Подайте их в камеру и выдержите в течение 10 минут.

Если используется терминальная трансфераза, пропустите этап загрузки олигодезоксинуклеотидов. Затем введите 20 µL раствора ДНК в шприц, подайте его в камеру со скоростью 10 µL/мин и выдержите в течение 30 минут. После 30-минутной инкубации промойте проточную камеру 40 µL 1X ТЕ-буфера со скоростью 50 µL/мин.

После промывки заполните камеру 40 µL того же FP-DBP в концентрации 80 nM в 1X TE. Для того чтобы увидеть полный диапазон растяжения молекул ДНК, используйте различные скорости потока в зависимости от длины используемых фрагментов ДНК. Наблюдайте за ДНК под объективом 60X с помощью флуоресцентного микроскопа. Ниже представлено видео с флуоресцентного микроскопа, на котором показаны молекулы ДНК бактериофага лямбда, прикрепленные к поверхности и растягиваемые потоком после лигирования с биотинилированными комплементарными олигонуклеотидами.

В условиях потока полностью вытянутые молекулы ДНК имеют длину 16,5 микрон. Для сравнения, молекулы ДНК бактериофага T4 при воздействии потока вытягиваются до длины 56,4 микрон. Это удлинение является обратимым, и ДНК может растягиваться и сжиматься многократно.

После просмотра этого видео вы должны хорошо разобраться в использовании FP-DBP для анализа длинных молекул ДНК, а также продемонстрировать процессы растяжения и релаксации полимера ДНК.