Визуализация поверхностного привязанным Большой Молекулы ДНК с флуоресцентной ДНК связыванием белков пептид

Общая цель этой процедуры, состоит в том, чтобы сделать удобную систему анализа ДНК для эпифлуоресцентного микроскопа, чтобы манипулировать одномолекулярной ДНК на модифицированных стеклянных поверхностях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области визуализации ДНК. При исследовании ДНК сама, а также ДНК-связывающие белки и другие малые молекулы.

Основным преимуществом этой методики является возможность с легкостью наблюдать и анализировать движущуюся ДНК. Для начала поместите стеклянные покровные стекла на стойку из ПТФЭ и закрепите их на месте с помощью куска уплотнительной ленты с резьбой из ПТФЭ. После того, как вы обернете покровные стекла, оставьте пятисантиметровый кусок ленты для работы со стеллажом во время процедуры очистки.

В вытяжном шкафу соедините 350 миллилитров серной кислоты и 150 миллилитров перекиси водорода в литровом стеклянном стакане, чтобы получился раствор для травления пираньи. Затем поместите в раствор стеллаж с покровными стеклами. Через два часа опорожните стакан и тщательно промойте покровные стекла деионизированной водой.

Продолжайте полоскать покровные стекла до тех пор, пока рН воды в стакане не достигнет нейтрального рН. Затем обработайте стойки покровных стекол ультразвуком в стакане в воде в течение 30 минут, чтобы очистить и удалить стеклянные подложки. Слейте воду из стакана, непосредственно перед аминозиланизацией. Для начала приготовьте раствор для аминозиланизации, добавив два миллилитра алкоксисилана и 10 миллилитров ледяной уксусной кислоты к 200 миллилитров метилового спирта в чистую полипропиленовую емкость.

Затем поместите чистые покровные стекла в раствор. Затем поместите очищенные покровные стекла в приготовленный раствор и встряхните их при комнатной температуре и 100 оборотах в минуту в течение 30 минут. Далее обработайте емкость ультразвуком с дериватизированными покровными стеклами в течение 15 минут при мощности 75 Вт.

Затем снова встряхните их при комнатной температуре и 100 оборотах в минуту в течение не менее 30 минут. Когда закончите, вылейте раствор из стакана и тщательно промойте покровные листочки три раза. Один раз метиловым спиртом и два раза этиловым спиртом.

После окончательного полоскания храните покровные стекла в этиловом спирте и используйте их в течение двух недель. Сначала сделайте 10 миллилитров 0,1 моляра раствора бикарбоната натрия и отфильтруйте его через шприцевой фильтр 0,22 микрона. Затем растворите два миллиграмма биотина ПЭГ сукцинимидилкарбоната и 80 миллиграммов ПЭГ сукцинимидилвалерата в 350 микролитрах отфильтрованного раствора бикарбоната натрия.

Защитите раствор от света с помощью светозащитной трубки. Энергично перебейте пробирку в течение 10 секунд, а затем центрифугируйте ее при давлении 10 000 x g в течение одной минуты, чтобы удалить любые пузырьки. Далее промойте предметное стекло ацетоном с последующим добавлением этилового спирта.

После промывки дайте предметному стеклу полностью высохнуть на воздухе. Нанесите каплю 50 микролитров раствора ПЭГ на чистое стеклянное стекло. Медленно опустите аминосилированный покровный стекло на каплю под небольшим углом, чтобы под ним не образовались пузырьки воздуха.

Затем поместите предметные стекла в ровную, темную и увлажненную камеру не менее чем на три часа до ночи при комнатной температуре. Когда закончите, запечатайте остаточный раствор ПЭГ в светозащитную трубку и держите ее при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации тщательно промойте полиэтиленовые покровные стекла деионизированной водой, а затем храните их в темном и сухом месте до тех пор, пока они не будут использованы.

Чтобы создать проточную камеру, поместите двусторонние полоски липкой ленты на акриловый держатель таким образом, чтобы он был выровнен перпендикулярно входным и выходным отверстиям и не нарушал ни одно из отверстий канала. Затем потрите ленту с помощью наконечника пипетки, чтобы запечатать каналы. Затем поместите покровное стекло PEGylated стороной вниз на верхнюю часть ленты, чтобы получилась проточная камера.

Чтобы предотвратить утечку раствора, прижмите верхнюю часть защитного стекла к месту, где размещен двусторонний скотч. Затем добавьте быстро высохший эпоксидный клей по краям камер, чтобы закрепить его на месте. Далее подсоедините кусок трубки длиной 2,5 сантиметра к газонепроницаемому шприцу и заклейте стык эпоксидным клеем.

Затем подсоедините длинную гибкую трубку к трубке, идущей из шприца. И снова заклеиваем стык эпоксидным клеем. Наполните трубку, которая подключена к шприцу, деионизированной водой, убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.

Далее вставьте трубку в отверстие проточной камеры, которое запечатано эпоксидным клеем. А на другое отверстие поместите наконечник для пипетки объемом 200 микролитров, который будет использоваться в качестве резервуара. Установите скорость потока шприцевого насоса на уровне 50 микролитров в минуту.

Затем влейте в камеру 20 микролитров раствора белка авидина и подержите его там в течение 10 минут. Далее загрузите в шприц 20 микролитров биотинилированных олигодезоксинуклеотидов. Влейте его в камеру, и подержите там 10 минут.

Если используется терминальная трансфераза, пропустите загрузку олигодезоксинуклеотидов. Затем загрузите в шприц 20 микролитров раствора ДНК, влейте его в камеру со скоростью 10 микролитров в минуту и подержите там 30 минут. После 30-минутной инкубации промойте проточную камеру 40 микролитрами буфера 1X TE со скоростью 50 микролитров в минуту.

После промывки загрузите в камеру 40 микролитров того же FP-DBP в концентрации 80 наномоляров, в 1X TE.To увидеть полный диапазон растяжения молекул ДНК, применить различные скорости потока в соответствии с используемой длиной ДНК. Наблюдайте за ДНК под объективом 60X с помощью флуоресцентного микроскопа. Вот видео с флуоресцентным микроскопом, показывающее, как молекулы ДНК бактериофага лямбда, привязанные к поверхности, растягиваются потоком после лигирования биотинилированными комплементарными олигонуклеотидами.

Под потоком полностью вытянутые молекулы ДНК имеют длину 16,5 микрон. Напротив, бактериофаг Т4 DNA momlecules, удлиненный до длины 56,4 мкм, находится под действием потока. Это удлинение обратимо, и ДНК может удлиняться и расслабляться несколько раз.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать FP-DBP в более крупном анализе ДНК, а также продемонстрировать растяжение и расслабление полимера ДНК.