Полностью автоматизированный центробежный Микрожидкостных Устройство для сверхчувствительного обнаружения белка из цельной крови
16 апреля 2016 г.
Этот протокол демонстрирует, как достичь фемтомолярной чувствительности обнаружения белков в 10 μл цельной крови в течение 30 минут. Это может быть достигнуто за счет использования электропрядильных нановолокнистых матов, интегрированных в лабораторию на диске, которая обеспечивает большую площадь поверхности, а также эффективное смешивание и промывку для улучшения соотношения сигнал/шум.
Общая цель этой процедуры заключается в повышении чувствительности обнаружения ИФА с использованием натуральных нановолокон. В этом видео показано, как достичь фемтомолярной чувствительности обнаружения белков в 10 микролитре образцов цельной крови в течение 30 минут. В лабораторной платформе-на-диске центробежная сила используется для передачи жидкости по камерам, и весь процесс полностью автоматизирован.
Чувствительность обнаружения может быть значительно увеличена за счет интеграции нановолокон. Однако проблема заключалась в том, что нановолокно очень хрупкое и сложное в обращении. В этом видео мы познакомимся с простым процессом крепления хрупких ковриков из нановолокна диоксида титана на пластиковый диск.
Для изготовления матов из нановолокна диоксида титана на силиконовой подложке методом электропрядения силиконовую подложку сначала силанизируют, покрывают PDMS и предварительно отверждают. Затем коврик из нановолокна переносится на этот предварительно отвержденный PDMS, и этот продукт пробивается, чтобы получить круглую деталь для крепления. Смажьте реакционную камеру каплей PDMS в качестве клея и прикрепите круглую деталь к нижней части камеры.
Затем высушите PDMS в духовке. Наконец, соберите слои диска в одно комплектное устройство для ИФА. Этот метод переноса нановолокон позволяет нам использовать большую площадь поверхности нановолокон для биоанализа.
Центробежное микрофилитическое устройство обеспечивает полную интеграцию и автоматизацию всех процессов, необходимых для ИФА. Основное преимущество этой методики перед другими существующими методами заключается в том, что она позволяет обнаруживать фемтомолярные концентрации белков всего в 10 микролитре цельной крови. Приготовьте растворы прекурсоров, как описано в прилагаемом протоколе испытаний.
Затем загрузите раствор в электроспиннер и изготовьте нановолокна методом электропрядения, используя оптимальные условия. Когда маты из полимерного нановолокна подготовлены, прокалите их в печи под вакуумом. После прокаливания маты из нановолокна диоксида титана окончательно подготавливаются.
Подготовьте микросхему с помощью программного обеспечения для 3D-проектирования, такого как SOLIDWORKS, и перенесите конструкцию на фрезерный станок с ЧПУ. Управляйте фрезерным станком с ЧПУ для изготовления диска с каналами и камерами. Диск и коврик из нановолокна теперь готовы к интеграции.
Подготовьте вакуумную камеру, силиконовую подложку и фторсилан. Силанизируйте силиконовую подложку фторсиланом под вакуумом в течение 30 минут. Приготовьте гостевой PDMS, приготовив преполимер с отвердителем в соотношении 10 к одному, и нанесите слой на силанизированную силиконовую подложку со скоростью 650 об/мин в течение 60 секунд.
Отверждайте PDMS, нанесенную на силанизированную пластину, при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы она стала клейкой. Теперь перенесите эти коврики из нановолокна на силикон с покрытием PDMS, приложив соответствующее давление с помощью плоского предмета, такого как предметное стекло. Выпекайте образец при температуре 80 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы полностью отверждать клей PDMS.
Нанесите несколько капель этанола на коврики из нановолокна, прикрепленные к слою PDMS, и сделайте отверстие диаметром шесть миллиметров с помощью PunchIt. Затем отделить от силиконовой подложки перфорированные нанофибровые маты, прикрепленные на PDMS. Затем покройте реакционную камеру связывания в диске примерно 20 микролитрами смеси PDMS и поместите нановолокна, прикрепленные к PDMS, в камеры.
Затем инкубируйте интегрированный диск из нановолокна при температуре 80 градусов Цельсия в течение одного часа. Приготовьте 1%-ный объемный раствор GPDES в этаноле. Затем обработайте нановолокна в диске кислородной плазмой.
Нанесите по 100 микролитров раствора GPDES на каждый коврик из нановолокна и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов в герметичном контейнере. После инкубации удалите раствор GPDES, постучав диском по стеклоочистителю. Вымойте этанолом, выньте и запекайте при температуре 80 градусов Цельсия в течение часа.
После запекания вымойте этанолом и вытащите на тап. Повторите этот процесс и высушите феном с помощью струи азота. Для иммобилизации антител дозируют разведенный раствор захваченного антитела.
Держите диски во влажной камере, и инкубируйте при температуре 37 градусов в течение четырех часов. Смойте остатки раствора с помощью промывочного буфера. Теперь соберите диск с помощью двустороннего скотча.
Приложите разумное давление, чтобы собрать слои в полный диск. Заполните реакционные камеры связывания блокирующим буфером и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Дважды промойте с помощью моющего буфера и храните диск при температуре 40 градусов Цельсия до использования.
Загрузите реактивы, промывочные буферы и 10 микролитров цельной крови в камеры для реагентов и образцов. Поместите диск в специально изготовленный аппарат визуализации для автоматизированного иммунологического анализа. Система визуализации содержит ротор, подключенный к компьютеру для автоматизированной работы диска, а также стробоскоп и ПЗС-камеру для съемки изображений.
Вращайте диск со скоростью 3 600 об/мин в течение 60 секунд, чтобы отделить эритроциты. Смешайте плазму с антителами для обнаружения. Перенесите смесь в реакционную камеру, интегрированную с матом из нановолокна диоксида титана.
После иммунореакции промойте нановолокна, перенеся промывочный буфер в реакционную камеру. Затем перенесите раствор хемилюминесцентного субстрата в реакционную камеру связывания и инкубируйте в режиме смешивания в течение одной минуты. Наконец, перенесите прореагировавший раствор субстрата в камеру обнаружения.
Когда вся реакция будет завершена, перенесите диск в систему обнаружения и считайте хемилюминесцентный сигнал с помощью специально разработанного программного обеспечения. Дисковое управление и система обнаружения могут быть интегрированы в единую платформу. Путем оптимизации напряжения и фтората были получены однородные маты из нановолокон, как показано на этом изображении SEM.
Для оптимизации времени отверждения PDMS была измерена сила адгезии. Если он был слишком коротким, коврик из нановолокна встраивали в PDMS или отслаивали, если он был слишком длинным. После оптимизации коврик из нановолокна был надежно прикреплен к PDMS.
Линейный диапазон обнаружения С-реактивного белка с двух платформ показан на этом графике. Используя лабораторию целостности нановолокна на диске, мы смогли достичь значительно повышенной чувствительности обнаружения С-реактивного белка всего из 10 микролитров сыворотки в течение 30 минут. Доступные в настоящее время технологии, такие как 96-луночный ИФА на основе планшетов, требуют большего объема образца и более длительного времени обнаружения.
В целом, интегрированный дисковый ИФА на основе нановолокна показал широкий динамический диапазон в шесть порядков величины с пределом обнаружения в шесть фемтомоле С-реактивного белка. Эта чувствительность обнаружения, чему способствовала большая площадь поверхности, обеспечиваемая нановолокном, встроенным в диск, превышала таковую у обычного ИФА, которая была ограничена 2000 фемтомолей. Мы надеемся, что после просмотра этого видео у вас сложилось хорошее понимание того, как подготовить центробежное микрофилитическое устройство, как интегрировать фазальные нановолокна и как выполнить детектирование белка с помощью ИФА.
Этот метод может быть полезен для обнаружения белков с низким уровнем связи в очень небольшом количестве биологических образцов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе демонстрируется способ достижения фемтомолярной чувствительности детектирования белков в 10 µL цельной крови в течение 30 минут. Метод основан на использовании электропряденых нановолоконных матов, интегрированных в платформу «лаборатория на диске», что позволяет повысить отношение сигнал/шум за счет эффективного перемешивания и промывки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Детекция белков
- Нанотехнология
Теоретическая часть
- ИФА (ELISA) является распространенным методом детекции белков.
- Повышение чувствительности детектирования имеет решающее значение для точной диагностики.
- Природные электроспиннинговые нановолокна могут повысить чувствительность, но они хрупкие.
- Автоматизированные системы «лаборатория на диске» позволяют оптимизировать этот процесс.
Цель исследования
- Для повышения чувствительности детектирования методом ELISA.
- Для демонстрации использования нановолокон в системе «лаборатория на диске».
- Для предоставления метода работы с хрупкими нановолоконными матами.
Используемые методы
- Интеграция матов из нановолокон диоксида титана на пластиковом диске.
- Использование центробежной силы для перемещения жидкостей между камерами.
- Автоматизация всего процесса детекции.
- Оценка чувствительности детекции в образцах цельной крови.
Основные результаты
- Достигнута фемтомолярная чувствительность при детектировании белков.
- Продемонстрированы эффективные возможности перемешивания и промывки.
- Показана возможность использования хрупких нановолокон в практическом применении.
- Подтверждена эффективность автоматизированного процесса для экспресс-анализа.
Заключение
- Интеграция нановолокон значительно повышает чувствительность детектирования.
- Технология «лаборатория на диске» представляет собой перспективный подход для проведения белкового анализа.
- Данный метод может быть адаптирован для различных диагностических приложений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная технология отвечает критической потребности в сверхчувствительном детектировании белков в клинических образцах малого объема, что позволяет обнаруживать биомаркеры на ранних стадиях при использовании минимального количества цельной крови. Благодаря интеграции электроспиннинговых нановолокон в центробежную микрофлюидную платформу достигается фемтомолярная чувствительность в течение 30 минут, что значительно улучшает предел обнаружения по сравнению с традиционным методом ELISA. Это достижение способствует валидации мишеней и идентификации перспективных соединений-лидеров за счет снижения количества ложноотрицательных результатов при скрининге белков с низкой экспрессией, что напрямую влияет на снижение рисков на доклиническом этапе и принятие решений по приоритизации портфеля препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать белковые мишени с низкой концентрацией в цельной крови, повышая достоверность ассоциаций между мишенью и заболеванием.
- Операционная ценность: сокращает расход образца до 10 µL, что позволяет использовать ценные клинические материалы в нескольких различных анализах.
- Прогностическая ценность: фемтомолярный предел обнаружения улучшает соотношение сигнал/шум, обеспечивая более надежное количественное определение биомаркеров в процессах поиска.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную автоматизированную платформу для разработки иммуноанализов с воспроизводимым дозированием и смешиванием жидкостей.
- Операционная ценность: Исключает этапы ручного пипетирования, что снижает вариативность и увеличивает пропускную способность при проведении кампаний по скринингу антител.
- Готовность анализа: Поддерживает мультиплексный анализ с минимальным расходом реагентов, что облегчает валидацию мишеней на основе панелей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает связь между этапом открытия и доклинической валидацией за счет возможности стабильного количественного определения белков в образцах различных типов и объемов.
- Снижение рисков: Высокая чувствительность уменьшает вероятность пропуска ранних фармакокинетических или фармакодинамических сигналов в моделях заболеваний.
- Доклиническая применимость: Совместимость с малыми объемами крови лабораторных животных позволяет проводить лонгитюдные исследования без необходимости терминального забора проб.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишеней на основе гипотез посредством количественного определения белков в клинически значимых матрицах.
- Открывающая биология: облегчает снижение механистических рисков, обеспечивая обнаружение специфических для данного пути биомаркеров в цельной крови, что повышает уверенность в выборе мишени.
- Скрининг: обеспечивает производительность иммуноанализа, готовую к автоматизации, с точным дозированием жидкости и промывкой, что крайне важно для воспроизводимой валидации хитов.
- Аналитика: генерирует количественные хемилюминесцентные показатели в диапазоне шести порядков, позволяя точно сравнивать экспрессию белков в различных условиях.
- Трансляционные исследования: поддерживает согласование биомаркеров путем обнаружения клинически значимых белков (например, CRP, cTnI) в крови с минимальной степенью обработки.
- Корпоративное повторное использование: конструкция «лаборатория на диске» позволяет адаптировать платформу для различных иммуноанализов, способствуя стандартизации реагентов и рабочих процессов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет улучшения пределов обнаружения и динамического диапазона.
- Операционная ценность: Полная автоматизация сокращает время непосредственной работы и вариабельность действий пользователя, что повышает воспроизводимость анализа в разных центрах.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе надежных данных о биомаркерах из ограниченного количества образцов, снижая риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, обеспечивая надежный количественный анализ низкоэкспрессионных мишеней на ранних этапах разработки.
Особенности реализации
- Для успешного изготовления требуются экспертные знания в области электроспиннинга, работы с нановолокнами и проектирования микрофлюидных устройств.
- Процесс зависит от наличия доступа к фрезерному станку с ЧПУ, установке для плазменной обработки и вакуумному оборудованию для подготовки дисков и нановолоконных матов.
- Необходима стандартизация протоколов нанесения и отверждения PDMS для обеспечения стабильной адгезии нановолокон между различными партиями.
- Адаптация метода для альтернативных белковых мишеней требует повторной оптимизации химии поверхности и условий инкубации.
- Практические ограничения включают необходимость контролируемых условий окружающей среды при переносе нановолокон и возможную вариабельность однородности волоконного мата.
