Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной В Ситу Гибридизация (FISH) с зондами PNA Caenorhabditis Элеганс

Общая цель этого метода флуоресцентной гибридизации in situ состоит в том, чтобы кратко проанализировать количество и длину теломер у C.Elegans. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о регенезе опухоли, альтернативном удлинении теломер и клеточном старении. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процедуры являются краткими, а теломеры могут быть визуализированы и количественно оценены менее чем за 24 часа.

Соберите прикорм взрослых червей с небольшим количеством жидких сред без мусора в 15-миллилитровую пробирку. Теперь промойте червей три раза следующим образом. Добавьте буфер М9 на общий объем 15 миллилитров.

Затем закрутите трубку при 300 G в течение трех минут, и слейте раствор над гранулами червей. Затем повторите процесс. Если после центрифугирования червяки плавают, то ослабьте тормоз на центрифуге.

После третьей промывки оставьте от червей 5 миллилитров М9. Затем добавьте 6,5 миллилитров дистиллированной воды, два миллилитра гиперхлорита и один миллилитр пяти моляров гидроксида калия. Дайте червям инкубироваться в этом отбеливающем растворе в течение трех минут при перемешивании 50 об/мин. Затем сделайте червей вихревыми, чтобы разрезать их и освободить их яйца.

Под микроскопом вскрытия ищите высвободившиеся яйца. Если они еще не выпущены, продолжайте инкубацию или до восьми минут. Если глисты в основном растворились, а яйца свободны, заполните пробирку до 15 миллилитров М9 и промойте яйца три раза так же, как черви промывались ранее.

К промытым яйцам, удалив большую часть М9, заполните объем до 500 микролитров PBST, а затем добавьте 500 микролитров 4%PFA. Теперь загрузите 40 микролитров аликвот яиц в 2% PFA в лунки с полилизиновым покрытием предметных стекол. Затем перенесите предметные стекла во увлажненную камеру и дайте им поинкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре.

Для этого протокола у вас должен быть алюминиевый блок на сухом льду, хранящийся при температуре 80 градусов Цельсия. Кроме того, метанол и ацетон должны храниться при температуре 20 градусов Цельсия. После того, как этап фиксации будет завершен, удалите большую часть раствора PFA со стекол, оставив около пяти микролитров.

Затем поместите вторые предметные стекла с полилизиновым покрытием на каждое предметное стекло так, чтобы две поверхности с покрытием склеились, захватывая ткани в лунке. Если есть избыток фиксатора, протрите его салфеткой. Теперь заморозьте слайды, поместив их на холодный алюминиевый блок не менее чем на 15 минут.

Тем временем приготовьте метаноловые и ацетоновые ванны на льду для горок. Как только предметные стекла застынут, скрутите одно из них, чтобы заморозить взлом образца. Выбросьте верхнюю горку и замочите нижнюю горку в ледяном метаноле на пять минут.

Сделайте это для всех образцов. Замораживание позволяет проникать зондам и антителам через твердую яичную скорлупу. Если яйца успешно замерзли, треснувшие, вы можете увидеть яйца на обоих слайдах.

Проработав не менее пяти минут в метаноле, переместите предметные стекла в холодный ацетон на пять минут. Еще через пять минут замочите образцы в PBST три раза по пять минут за каждую ванну. После промывки PBST предметные стекла могут храниться в 100% этаноле при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней.

Чтобы продолжить, добавьте 20 микролитров раствора РНКазы в лунки для образцов и инкубируйте их во увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Затем промойте предметные стекла в 2x SSCT два раза по 15 минут за промывку. После двух промывок добавьте к образцам 20 микролитров гибридизационного раствора и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа во увлажненной камере.

Тем временем подготовьте зонд для двухцепочечного зонда ДНК. Денатурируйте его при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем кратковременно охладите на льду. Через час отсасывайте раствор для гибридизации и добавьте раствор зонда.

С этого шага вперед защищайте образец от света. После добавления щупа накройте образцы стеклянными покровными стеклами. Затем сделайте увлажненную камеру на термоблоке с температурой 80 градусов Цельсия.

Когда нагревательный блок стабилизируется до 80 градусов по Цельсию, поместите предметные стекла в нагретую камеру и дайте им денатурироваться в течение трех минут. Затем инкубируйте все обработанные предметные стекла во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. После ночной инкубации промойте образцы в PBST при комнатной температуре в течение пяти минут.

При подготовке подогрейте гибридизационный раствор до 37 градусов Цельсия за час до мытья. Затем загрузите предметные стекла в банку с раствором для промывки гибридизации и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Чтобы удалить гибридизационный раствор, промывайте образцы PBST при комнатной температуре в течение 15 минут.

Сделайте это три раза. После отсасывания последней промывки PBST добавьте 20 микролитров блокирующего раствора в каждый образец и инкубируйте их во увлажненных камерах при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. Затем аспирируйте блокирующий раствор и замените его конъюгированным раствором антидигоксигенинового антитела FITC в соотношении один к 200.

Накройте горки крышками и выдержите их при комнатной температуре в течение трех часов в темноте. После окрашивания антителами промойте образцы дважды PBST в течение 15 минут за одну стирку в темноте. Далее отсасывайте PBST и заменяйте его 10 микролитрами монтажного раствора, содержащего DAPI.

Нанесите покровное стекло и впитайте излишки раствора. Наконец, заклейте края покровного стекла лаком для ногтей и продолжайте наблюдение за образцами под флуоресцентным микроскопом. С помощью зонда PNA были изучены теломеры животных, переживших мутацию, достаточную для теломер.

В половых железах количество теломер на ядро поддается количественной оценке. Сигнал теломер был локализован совместно с сигналом TALT1, что подтверждает идею о том, что TALT1 отвечает за выживание без теломер. Интенсивность сигнала теломер сравнивали с помощью программного обеспечения.

Сигнал был сильнее у выживших у выживших у АЛТ, чем у родительских штаммов, использованных для создания мутантов с дефицитом теломер. Не забывайте, что работа с параформальдегидом и формамидом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.