Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной

Общая цель данного метода флуоресцентной гибридизации in situ заключается в кратком анализе количества и длины теломер у C.Elegans. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о регенерации опухолей, альтернативном удлинении теломер и клеточном старении. Основным преимуществом данной техники является краткость процедур, позволяющая визуализировать и количественно оценить теломеры менее чем за 24 часа.

Соберите взрослых обсемененных червей с небольшим количеством жидкой среды без остатков клеточного дебриса в пробирку объемом 15 мл. Затем трижды промойте червей следующим образом. Добавьте буфер M9 до достижения общего объема 15 мл.

Затем центрифугируйте пробирку при 300 G в течение трех минут и удалите раствор, находящийся над осадком червей. Затем повторите этот процесс. Если после центрифугирования черви остаются во взвешенном состоянии, уменьшите торможение центрифуги.

После третьей промывки оставьте червей в 5 мл M9. Затем добавьте 6,5 мл дистиллированной воды, 2 мл гипохлорита и 1 мл 5 М гидроксида калия. Инкубируйте червей в этом отбеливающем растворе в течение трех минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин. Затем подвергните червей воздействию вортекса, чтобы разрушить их тело и высвободить яйца.

Под диссекционным микроскопом проверьте, вышли ли яйца. Если они еще не вышли, продолжайте инкубацию в течение восьми минут. Если черви в основном растворились и яйца свободны, долейте в пробирку M9 до 15 миллилитров и промойте яйца трижды, точно так же, как промывались черви ранее.

К промытым яйцам, после удаления большей части среды M9, доведите объем до 500 µL с помощью PBST, а затем добавьте 500 µL 4% PFA. Затем поместите аликвоты яиц объемом 40 µL в 2% PFA в лунки предметных стекол, покрытых полилизином. Перенесите стекла в увлажненную камеру и инкубируйте их в течение 15 минут при комнатной температуре.

Для данного протокола подготовьте алюминиевый блок на сухом льду при температуре 80 °C. Также подготовьте метанол и ацетон, хранящиеся при температуре 20 °C. После завершения этапа фиксации удалите большую часть раствора PFA со слайдов, оставив около 5 µL.

Затем наложите вторые стекла, покрытые полилизином, поверх каждого предметного стекла с образцом так, чтобы две покрытые поверхности прилипли друг к другу, зафиксировав ткани в лунке. Если зафиксирующего вещества слишком много, удалите его салфеткой. Теперь заморозьте стекла, поместив их на холодный алюминиевый блок минимум на 15 минут.

Тем временем подготовьте на льду ванночки с метанолом и ацетоном для предметных стекол. Как только стекла заморозятся, поверните одно из них, чтобы образец треснул при заморозке. Удалите верхнее стекло и выдержите нижнее стекло в ледяном метаноле в течение пяти минут.

Повторите эту процедуру для всех образцов. Замораживание с последующим растрескиванием позволяет зондам и антителам проникнуть сквозь твердую яичную скорлупу. Если яйца были успешно растресканы методом замораживания, они будут видны на обоих предметных стеклах.

После выдержки в метаноле в течение не менее пяти минут перенесите предметные стекла в холодный ацетон на пять минут. Затем трижды промойте образцы в PBST по пять минут в каждой ванне. После промывки в PBST предметные стекла можно хранить в 100% этаноле при температуре four degrees celsius в течение нескольких дней.

Для продолжения добавьте 20 µL раствора РНказы в лунки с образцами и инкубируйте их во влажной камере при 37 °C в течение одного часа. Затем промойте стекла в 2x SSCT дважды, по 15 минут за каждую промывку. После двух промывок добавьте 20 µL раствора для гибридизации к образцам и инкубируйте их при 37 °C в течение одного часа во влажной камере.

Тем временем подготовьте зонд для двухцепочечной ДНК. Денатурируйте его при 95 °C в течение пяти минут, а затем кратковременно охладите на льду. Через час аспирируйте раствор для гибридизации и добавьте раствор зонда.

Начиная с этого этапа, защищайте образец от воздействия света. После добавления зонда накройте образцы стеклянными покровными стеклами. Затем создайте увлажненную камеру на нагревательном блоке с температурой 80 °C.

Когда нагревательный блок снова стабилизируется при 80 °C, поместите предметные стекла с образцами в прогретую камеру и оставьте их для денатурации на три минуты. Затем инкубируйте все обработанные стекла в увлажненной камере при 37 °C в течение ночи. После ночной инкубации промойте образцы в PBST при комнатной температуре в течение пяти минут.

В качестве подготовки за один час до промывки подогрейте гибридизационный раствор до 37 °C. Затем поместите предметные стекла в емкость с гибридизационным промывочным раствором и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 минут. Для удаления гибридизационного раствора промойте образцы раствором PBST при комнатной температуре в течение 15 минут.

Повторите эту процедуру три раза. После аспирации последней промывки в PBST добавьте по 20 µL блокирующего раствора в каждый образец и инкубируйте их в увлажненных камерах при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. Затем удалите блокирующий раствор и замените его раствором антител к дигоксигенину, конъюгированных с FITC, в разведении 1:200.

Накройте предметные стекла и инкубируйте их при комнатной температуре в течение трех часов в темноте. После окрашивания антителами дважды промойте образцы раствором PBST по 15 минут на каждую промывку в темноте. Затем аспирируйте PBST и замените его 10 microliters закрепляющего раствора, содержащего DAPI.

Накройте образец покровным стеклом и удалите излишки раствора. В завершение зафиксируйте края покровного стекла бесцветным лаком для ногтей и приступите к наблюдению за образцами под флуоресцентным микроскопом. С помощью PNA-зонда были изучены теломеры животных, выживших после мутации, достаточной для сохранения длины теломер.

В гонадах количество теломер на одно ядро поддается количественному определению. Сигнал теломер совпадал по локализации с сигналом TALT1, что подтверждает гипотезу о том, что TALT1 отвечает за выживаемость при отсутствии теломер. Интенсивность сигнала теломер сравнивали с помощью программного обеспечения.

Сигнал был сильнее в клетках, выживших после ALT, чем в родительских штаммах, использованных для создания мутантов с дефицитом теломер. Не забывайте, что работа с параформальдегидом и формамидом может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток.