Ковалентное присоединение одиночных молекул для спектроскопии силы на основе AFM

Одноя молекула силы спектроскопии позволяет измерить физические параметры, которые описывают механические и клеевые свойства полимеров. При использовании силовой спектроскопии на основе AFM для изучения отдельных молекул необходимо иметь надежный и эффективный протокол для ковалентной привязки этих молекул к наконечнику кантилевера AFM. Этот протокол может быть принят для многих различных полимеров, независимо от длины контура или гидрофобности.

Все шаги должны быть выполнены в дымовой капот, чтобы избежать вдыхания органических паров. Кроме того, требуется стекло, устойчивое к растворителям, лабораторное покрытие и защита глаз. Сначала используйте свежеочищенные пинцеты, чтобы поместить чипы AFM cantilever в плазменную камеру.

Запустите программу активации поверхности плазменной камеры, выбрав старт, а затем да. Убедитесь, что плазменный процесс работает должным образом. Плазменный процесс с высоким содержанием кислорода показывает светло-голубой цвет.

В то время как программа активации поверхности выполняется, растворите силан-PEG-mal в толуоле, чтобы получить концентрацию 1,25 миллиграмма на миллилитр. Поместите три миллилитров раствора в плоскую чашку Петри. После завершения плазменного процесса проветрить плазменную камеру, выбрав подтверждение, а затем вентиляционные отверстия.

Немедленно перейти к следующему шагу, с тем чтобы предотвратить поглощение загрязняющих веществ. Поместите чипсы в чашку Петри и инкубировать чипсы в течение трех часов при 60 градусах по Цельсию. Вынюйте чашку Петри из духовки и дайте ей остыть, по крайней мере 10 минут.

Затем промойте чипсы. Для СВЯЗЫВАНИя или полистирола трижды промойте чипсы толуолом. Для связывания полинипама чипсы следует промыть один раз толуолом и дважды этанолом.

Чтобы уменьшить воздействие капиллярных сил на кантилевер AFM, слегка наклоните чипы при полоскания. Чипы AFM cantilever необходимо промыть должным образом, чтобы удалить избыток физических полимеров, которые могут повлиять на эксперимент. Полоскания должны быть выполнены тщательно, чтобы предотвратить любые повреждения кантилеверов AFM.

Наконец, подготовьте по крайней мере две микросхемы в качестве элементов управления, которые не будут подвергаться ковалентной полимерной крепления. Для контроля против PEG и полистирола чипы, промыть дважды этанолом и один раз с водой. Для контроля по сравнению с полинипам чипсы, промыть дважды с водой.

Для выполнения ковалентного крепления ПЕГ или полистирола приготовьте три миллилитров полимерного раствора в толуоле при концентрации 1,25 миллиграмма на миллилитр. Добавьте раствор и чипсы в чашку Петри и инкубировать чипсы при 60 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации с PEG или полистирола, дайте чипсы остыть в течение 10 минут.

Промыть чипсы дважды толуолом, дважды этанолом и один раз водой. Для выполнения ковалентного крепления полинипама приготовьте три миллилитров полимерного раствора в этаноле при концентрации 1,25 миллиграмма на миллилитр. Добавьте раствор и чипсы в чашку Петри и инкубировать чипсы при комнатной температуре в течение трех часов.

После инкубации полинипамом, промыть чипсы дважды этанолом и дважды водой. Чтобы хранить чипсы до использования в эксперименте, поместите каждый чип отдельно в одну миллилитровую чашку Петри, наполненную водой. Держите чашки Петри на уровне четырех градусов по Цельсию.

Во-первых, вставьте функционализированный чип AFM cantilever в держатель чипа. Клей подготовленную поверхность в держатель образца, который подходит для измерений в жидкости. Используйте пипетки, чтобы погрузить чип в воду.

Намонтировать поверхность образца в AFM. Погрузите поверхность образца в воду. Подключите держатель чипа к AFM.

Затем подойди к чипу к поверхности образца. Используйте экологическую панель, чтобы установить целевую температуру и переключить режим и кнопки обратной связи радио на. Затем дайте системе уравностороться в течение примерно 15 минут.

Чтобы принять кривую расширения силы, подойди к наконечнику кантилевера AFM к поверхности и выберите одну силу. Полученная кривая отображает отклонение от расстояния пьезо с приближением к поверхности, показанной красным цветом, и опровержение, показанное синим цветом. Расширьте часть кривой, которая представляет собой отступ кончика кантилевера AFM, на основную поверхность.

Для выполнения линейной подгонки установите курсоры на подходе или кривой втягиваемого и выберите обновление INVOLS из контекстного меню. Полученное значение обратного значения чувствительности оптического рычага отображается в панели в левом верхнем. После повторения этой процедуры по крайней мере пять раз, рассчитать среднее значение обратной чувствительности оптического рычага и ввести среднее значение в панели.

Распоитите кантилевер AFM на высоте около 100 микрометров над поверхностью, выбрав переход к предварительному взаимодействию. Чтобы получить удовлетворительное соотношение сигнала к шуму для спектра теплового шума, установите усреднение, по крайней мере, до 10 и выберите максимально возможное разрешение частоты. Затем заместить спектр теплового шума, выбрав данные захвата тепловых.

Чтобы соответствовать спектру теплового шума с простой гармонической функцией осциллятора, расширьте часть кривой, представляющую первый резонансный пик. Затем выберите инициализировать подходят. Наконец, уточните пригонку с помощью кнопки тепловых данных.

Соответствующая константа силы появится в панели. Чтобы начать сбор данных, установите параметры эксперимента. Установите тяговую скорость до одного микрометра в секунду и завяди триггер до одного нанонютона.

Подойди к наконечнику кантилевера AFM к поверхности и выберите единую силу для записи одной кривой и определите, нужно ли корректировать параметры, описанные в рукописи. Выберите карту F из главной панели. Чтобы получить карту силы со 100 кривыми, установите количество точек силы и силовых линий до 10.

Начните записывать карту силы, выбрав карту do F. Возьмите силовые кривые расширения в сетке, как мода, чтобы избежать каких-либо локальных эффектов поверхности и в среднем различных поверхностных областях. После эксперимента повторите определение обратной чувствительности оптического рычага и пружинной константы, чтобы проверить консистенцию и стабильность системы.

Одиночные полимеры полинипама и PEG были ковалентно привязаны к наконечнику кантилевера AFM на одном конце и физисорбированы на поверхности диоксида кремния на другом конце. Для измерения поведения растяжения, зависящего от температуры, было определено четкое событие растяжения одной молекулы с последующим окончательным максимумом в конце соответствующей кривой расширения силы. Затем для каждой температуры была создана единая мастер-кривая.

Для ПЭГ при повышении температуры наблюдалось снижение силы растяжения. Для полинипама наблюдалась обратная тенденция. Десорпция полистирола с поверхности SAM в воде может быть использована для определения силы и длины desorption.

Когда полимерная крепление была успешной, кривые расширения силы показали плато постоянной силы. Каждое плато было оснащено сигмоидной кривой для определения силы desorption и длины desorption. Наблюдаемые силы desorption соответствовали ранее полученным значениям.

Когда более одного полимера, прикрепленного к наконечнику кантилевера AFM, каскады плато наблюдались в кривых расширения силы. С двумя полимерами прилагается, бимодального распределения было найдено для desorption длины в то время как сила desorption показал узкое распределение. Функциональный наконечник кантилевера AFM может быть использован для количественной оценки реакции силы отдельных молекул в жидкой среде и с внешними стимулами.

Использование чистого оборудования, растворителей, советов AFM cantilever и повторного полоскания очень важно для достижения высокого уровня чистоты, который должен быть подтвержден до описанных контролируемых экспериментов. Представленные протоколы и процедуры проложили путь к лучшему пониманию стимулов отзывчивых полимерных систем. Результаты можно напрямую сравнить с молекулярно-динамическим моделированием.