Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за разделением вирусных геномов в делящихся клетках. Это достигается путем создания плазмиды, которую можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. В этом случае плазмида конструируется таким образом, чтобы включать в себя тандемные повторы последовательности оператора лактозы или LAC O. Вторым шагом является введение плазмиды в делящиеся клетки с последующим заражением клеток ретровирусом, кодирующим репрессор лактозы, или LAC Eye, слитым с флуоресцентным белком.

Слитые белки репрессора лактозы будут специфически связывать последовательности операторов лактозы в плазмидном субботнике. Клетки контролируются с помощью флуоресцентной микроскопии для отслеживания отдельных плазмид на протяжении нескольких клеточных циклов. В конечном счете, полученные изображения обрабатываются, чтобы определить, как вирусные геномы поддерживаются в делящихся клетках.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как количественная ПЦР-блоттинг по Саузерну или флуоресцентная гибридизация in situ u, заключается в том, что этот метод позволяет наблюдать отдельные плазмиды в несколько моментов времени. Чтобы обеспечить визуализацию плазмиды с помощью флуоресцентной микроскопии, используются стандартные методы молекулярного клонирования для введения в плазмиду фрагмента ДНК, содержащего примерно 250 копий последовательности оператора лактозы или LAC O. В этом примере плазмида представляет собой заднюю середину примерно из 170 пар оснований, которая содержит весь геном вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Cap, или KSHV, и кодирует устойчивость к гигромицину.

Ввести LAC O-содержащую плазмидную ДНК в клетки хела и SLK млекопитающих путем трансфекции В 60-миллиметровых чашках инкубировать клетки с 10 микрограммами очищенной плазмиды, ДНК 25 микролитров, липэктомией, 2000 0,5 миллилитров, Optum и 3,5 миллилитров. DMEM на четыре часа. Замените среду на DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и дайте клеткам восстановиться в течение 48 часов.

Затем поместите трансфицированные клетки с низкой плотностью в большие чашки и культуру в течение трех недель в DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и 300 микрограммами на миллилитр гигромицина для отбора вводимой плазмиды, используйте кусочки стерильных трипов и пропитанную фильтровальную бумагу для переноса устойчивых к гигромицину колоний в чашки для новых культур. Поместите чашки в инкубатор через одну-две недели, когда трансфицированные клоны вырастут, чтобы заполнить чашку изоляцией ДНК для рестрикционного переваривания и южного блоттинга, чтобы убедиться, что полимер плазмиды LAC O однороден и имеет ожидаемый размер. Этот пример блоттинга показывает, что полимер LAC O в клоне является однородным и идентичным полимеру положительного контроля.

На седьмой полосе, если плазмида не была сконструирована для экспрессии слияния лактозного репрессора, лак глаз инфицирует подходящие клоны с ретровирусом, кодирующим лак глаз, слитый с красным флуоресцентным белком, таким как лак глаз, TD помидор, выбирается TD помидор вместо белков, которые флуоресцируют ближе к зеленому, чтобы свести к минимуму фототоксичность, которая может возникнуть при многократном воздействии в течение длительного времени. После введения белка слияния глаз LAC, культивируйте клетки в присутствии 200 мкг на миллилитр IPTG, чтобы блокировать гибридные белки от связывания ДНК. Одним из наиболее важных аспектов этой процедуры является получение клонов с соответствующей интенсивностью флуоресценции.

Большое количество клонов должно быть проверено для выявления тех, которые имеют оптимальную флуоресцентную культуру. Клетки в течение как минимум трех дней обеспечивают экспрессию клонов томатного белка TD глаза LAC для пациентов с оптимальным уровнем LAC глаза, TD томата, которые демонстрируют отчетливые сигналы с минимальными фоновыми уровнями несвязанного гибридного белка, за 24-48 часов до визуализации клеток, экспрессирующих томат LAC I TD, помещают их в стеклянную чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм с плотностью менее 10% конфлюенции. Это позволит парам клеток делиться на колонии от восьми до 16 клеток без перекрытия за один-три часа до начала визуализации.

Трижды промойте планшет питательной средой, в которой отсутствуют как селективные препараты, так и ИПТГ. Это вымывает нежизнеспособные клетки и позволяет белкам слияния глаз LAC связываться с LAC-цитами в плазмидах. Замените питательную среду двумя миллилитрами, DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и 25 миллимолярами Хиппи инкубируют в течение одного-трех часов непосредственно перед визуализацией, замените верхнюю часть чашки для культовой пленки культовой фольгой, натянутой в монтажном кольце для 35-миллиметровой чашки.

Эта оболочка будет препятствовать испарению питательной среды, что со временем увеличит концентрацию соли и убьет клетки. Система визуализации, используемая в этом эксперименте, состоит из инвертированного микроскопа Zeiss Axio 200 M, оснащенного моторизованным столиком, и ЭМ-ПЗС-камеры для чувствительного обнаружения сигналов. Флуоресцентный возбуждающий свет обеспечивается нейтральным белым светодиодом системы Collibra.

Система визуализации управляется программным обеспечением для автоматического получения изображений через длительные интервалы времени с несколькими стеками Z. Инкубатор на ступеньке используется для поддержания клеток при температуре 37 градусов Цельсия, от 5 до 10% углекислого газа в увлажненной камере. Используйте воротник с подогревом для масляного объектива, чтобы предотвратить его сифонирование.

Тепло от образца дает достаточно времени для того, чтобы система достигла стабильной температуры. Чтобы свести к минимуму артефакты движения во время эксперимента, система визуализации должна находиться на воздушном столе, чтобы быть изолированной от вибраций. Чтобы начать процедуру визуализации меченой ДНК, используйте ДВС-визуализацию для просмотра клеток и определения фокальной плоскости верхней и нижней части клеток в нескольких полях зрения в каждом поле, переместитесь в фокальную плоскость примерно на одну треть пути вниз от верхней части клетки, сохраните x, координаты y, Z в списке сохраненных позиций сцены.

Каждая из этих сохраненных позиций будет центром Зака изображений для захвата клетки в программном обеспечении для управления микроскопом, определения Зака изображений, которые должны быть выполнены в каждой сохраненной позиции стадии, определения достаточного количества срезов, чтобы была захвачена вся клетка вместе с дополнительными срезами выше и ниже плоскостей, в которых расположены клетки. Выберите размер шага Z от 0,35 до 0,50 микрона, чтобы обеспечить приблизительную выборку Найквиста в измерении Z. Эти срезы позволяют обнаруживать следящие движения клеток в течение клеточного цикла, а также используются для обработки стеков изображений после сбора данных.

В результате получится стопка от 40 до 60 изображений в зависимости от толщины ячеек. Определите эксперимент с временными рядами для получения изображения яркого поля вулкана Зак с интервалом в 30 минут и флуоресцентных изображений с интервалом от 10 до 60 минут. Не используйте ДВС-визуализацию во время эксперимента, так как она требует больше света, чем стандартная визуализация в светлом поле, которая может подвергнуть клетки неоправданному воздействию фототоксичности в ходе длительных экспериментов.

Запустите эксперимент с программным управлением. Убедитесь, что во время эксперимента система не нарушается. После того, как все изображения для эксперимента будут получены, просмотрите изображения для каждого Зака и отрежьте все ненужные области изображений, чтобы сократить время компьютерной обработки.

На следующем шаге необходимо переназначить интенсивность сигнала пикселю начала координат в каждом стеке Z. Используйте алгоритм деконволюции в программном обеспечении машинного зрения Axio, основанный на измеренной функции разброса точки системы визуализации. Результат деконволюции показан здесь.

Изучите изображения, чтобы отследить изменения интенсивности и движения плазмид во время клеточного цикла и разделения плазмид на дочерние клетки. Эти изображения, полученные вычислительным путем с учетом нескольких Z-плоскостей, в которых находятся различные сигналы, показывают, что ядра клеток HELOC, экспрессирующих томат LAC eye TD, флуоресцентны из-за сигнала ядерной локализации на гибридном белке, локализуя его в ядре. В отсутствие геномов I-P-T-G-K-S-H-V кодирующие последовательности LAC O рекрутируют множество копий флуоресцентного белка и выделяются яркими сигналами на фоне интенсивности ядра.

Напротив, в присутствии IPTG флуоресцентные белки глаза LAC не связываются с его распознаванием при отсутствии последовательности O, максимальной интенсивности проекций Зака приобретенного в течение пятикратного клеточного цикла. Точки в репрезентативном эксперименте показаны на этом рисунке. Флуоресцентно помеченные вирусные геномы в клетке, видимой на панели А, синтезируются в клетке, показанной на панели В. Вирусные геномы затем разделяются на дочерние клетки во время деления клеток, как это наблюдается на панелях С, D и Е. Клеточный цикл для здоровых клеток HELOC занимает примерно 24 часа, и дочерние клетки обычно прикрепляются рядом друг с другом и продолжают делиться в то же время в следующем клеточном цикле.

Используя этот протокол, вирусные геномы в клетке можно отслеживать в течение нескольких поколений. Важно помнить о том, что нужно следить за морфологией клеток во время генерации, чтобы убедиться, что клетки здоровы на протяжении всего эксперимента.