Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации связывающих белков малых молекул с помощью фотоаффинного зонда, который может связываться со своей мишенью в живых клетках, что позволяет впоследствии изолировать и идентифицировать мишень. Этот метод может быть использован для выяснения молекулярного механизма действия лекарственных препаратов или других малых молекул. Основное преимущество этой методики заключается в том, что связывание и ковалентное мечение белков-мишеней происходит в нативной клеточной среде, устраняя риск нарушения структуры нативного белка и условий связывания при лизисе клетки.

Начните эту процедуру, подготовив стерильные шестисантиметровые чашки для клеточных культур, для желаемого количества образцов. Как правило, на одно лечебное условие используется одна чашка клеток. Для этой демонстрации будут подготовлены три чашки клеток, а отрицательный контроль только с ДМСО, помеченным D, только зондовой обработкой, меченой P, и зондом плюс конкурентом, маркированным C.To каждой чашке для культивирования, добавят 3,5 миллиона HEK 293 Т-клеток в четыре миллилитра питательной среды.

Инкубируйте клетки на ночь. Перед обработкой клеток предварительно аликвотируйте необходимые препараты в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Для предварительной обработки конкурента добавьте по четыре микролитра ДМСО в каждую из двух пробирок и четыре микролитра 10 миллимоляра конкурента в одну пробирку.

Для обработки зондом добавьте 16 микролитров ДМСО в одну пробирку и 16 микролитров 15 микромолярного фотоаффинного зонда в каждую из двух пробирок. Поместите чашки для клеточных культур в колпак для клеточных культур для добавления предварительно аликвотированных препаратов. Отасуньте один миллилитр питательной среды из чашки для обработки соревнований, перенесите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую предварительно аликвотированного конкурента, и повторно суспендируйте препарат в среде.

Аккуратно добавьте средство и лекарственную смесь по каплям обратно в форму. Таким же образом добавьте ДМСО как в отрицательную контрольную чашку, так и в чашку зонда. Верните посуду в инкубатор на 30 минут.

Через 30 минут верните блюда обратно в культурный шкаф и приглушите свет. Добавьте предварительно аликвотированный ДМСО в отрицательную контрольную чашку, а щуп — в зонд и соревновательные чашки. Верните посуду в инкубатор на один час.

Через час поставьте посуду на лед. Аккуратно промойте клетки в каждой чашке пятью миллилитрами ледяного PBS, чтобы удалить излишки зонда. Повторно покройте ячейки четырьмя миллилитрами ледяного PBS.

Поместите чашку с ячейками, расположенную на расстоянии трех сантиметров под ультрафиолетовой лампой, поверх пакета со льдом, чтобы свести к минимуму нагревание от лампы, и облучайте в течение трех минут. Выньте блюдо и поставьте его на лед. Таким образом облучите все образцы.

После облучения всех образцов аспирируйте PBS из клеток, и добавьте в каждую чашку по 200 микролитров ледяного PBS с ингибиторами протеазы. Отделите ячейки от чашки с помощью резинового скребка и переложите в предварительно помеченные микроцентрифужные пробирки на льду. Добавьте SDS в каждый образец до конечной концентрации 0,4%Лизируйте клетки путем ультразвуковой обработки суспензии в течение 10 импульсов, инкубации на льду в течение одной минуты, а затем ультразвуковой обработки в течение еще 10 импульсов.

Кипятите образцы на нагревательном блоке, установленном при температуре 95 градусов Цельсия, в течение пяти минут, чтобы завершить лизис клеток и денатурировать все белки. После измерения концентрации белка в каждом образце, как описано в текстовом протоколе, нормализуйте концентрацию белка до 2,5 мг на миллилитр, добавив PBS PH 8,5 плюс 0,4% SDS по мере необходимости. Чтобы начать эту процедуру, переложите по 40 микролитров каждого клеточного лизата, приготовленного в предыдущем сегменте, в новую микроцентрифужную пробирку.

Добавьте следующие реактивы в таком порядке: 0,2 микролитра муки-азида, 0,58 микролитра ТЦП и 3,38 микролитра ТБТА. Вихрь перемешать. Добавьте 1,14 микролитра пентагидрата медного купороса, чтобы начать реакцию.

Вортекс ненадолго и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Добавьте 50 микролитров 2X SDS буфера для образца, чтобы погасить реакцию. Нанесите образцы на гель SDS-PAGE, и когда фронт красителя достигнет конца геля, продолжайте наносить гель еще пять минут, чтобы убедиться, что весь избыток непрореагировавшего азида муки полностью вышел из геля.

Смыв все излишки муки-азида, поместите гель на стеклянную пластину и отсканируйте гель с помощью сканера флуоресцентного геля, согласно инструкции производителя. Для прикрепления метки биотином используйте максимальное количество лизатов клеток после нормализации белка, чтобы все образцы были одинакового объема. Предварительно очистите лизаты, добавив каждый образец в новую пробирку, содержащую 50 микролитров предварительно промытых агарозных шариков стрептавидина высокой емкости.

Выдерживать в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия с вращением. Гранулируйте шарики методом центрифугирования. Удалите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку на льду, а шарики выбросьте.

На 500 микролитров лизата добавьте следующие реагенты: 1,38 микролитра биотин-азида, 5,5 микролитра ТЦПК и 32,5 микролитра ТБТА. Вихрь перемешать. Добавьте 11 микролитров пентагидрата медного купороса на 500 микролитров лизата и быстро

Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте четыре объема образца ацетона, охлажденного до 20 градусов Цельсия, обработайте образцы вихревыми и инкубируйте в течение ночи при температуре 80 градусов Цельсия, чтобы полностью осаждать белки и удалить непрореагировавший биотин-азид. На следующий день центрифугируйте образцы при 17 000 x g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать осажденные белки.

Полностью аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте в каждый образец 150 микролитров PBS PH 7,4 и 1% SDS и растворите белки с помощью ультразвука. Добавьте 600 микролитров PBS в каждый образец, чтобы разбавить концентрацию SDS до 0,2%, затем добавьте образец в новую пробирку, содержащую 30 микролитров предварительно промытых агарозных шариков стрептавидина высокой емкости. Выдерживать в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия с вращением.

Через час гранулируйте гранулы центрифугированием при 1000 х г в течение трех минут. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую несвязанные белки. Добавьте в бусины один миллилитр промывочного буфера, и выдержите пять минут при комнатной температуре с вращением.

Центрифугируйте, выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте с буфером для промывки. После окончательной промывки полностью отасуньте буфер для промывки из шариков и добавьте 30 микролитров буфера для образцов 2X SDS. Инкубируйте в течение пяти минут в нагревательном блоке при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы высвободить белки из гранул.

Центрифугируйте шарики при температуре 13000 x g при комнатной температуре в течение одной минуты. Тщательно пипетируйте буфер для образца, содержащий белки из гранул, для SDS-PAGE. Визуализация белков после мечения флуоресцентной меткой иллюстрируется этим флуоресцентным сканированным гелем.

Основная полоса специфических связывающих белков, составляющая приблизительно 35 килодальтон, присутствует только в зондовой полосе и конкурируется с избытком исходного соединения. Та же полоса в 35 килодальтон была визуализирована с помощью окрашивания серебром после снижения биотина, а затем идентифицирована с помощью масс-спектрометрии как мембранный белок VDAC1. Идентичность белка была дополнительно проверена с использованием специфического антитела к VDAC1.

Сигнал присутствует на полосе пробника, а снижается на полосе соревнований. Включение входной фракции гарантирует, что антитело работает, и представляющий интерес белок может быть обнаружен в лизате. Незначительное увеличение молекулярной массы образцов с вытягиванием происходит за счет ковально прикрепленного зонда.

Иллюстрируются последствия неправильного выполнения определенных шагов в протоколе. Неполное удаление излишков муки-азида приводит к появлению крупных черных пятен на дне флуоресцентного сканируемого геля, в то время как недостаточное предварительное очищение от лизатов и/или промывка шариков приводит к образованию окрашенного в серебристый цвет геля с очень высоким фоновым окрашиванием. От начала и до конца эксперимент с вытягиванием занимает от двух до трех дней.

После того, как целевой белок был выделен и идентифицирован с помощью масс-спектрометрии или вестерн-блоттинга, следует провести дальнейшие эксперименты по валидации, специфичные для мишени, чтобы оценить релевантность мишени для лекарственно-индуцированного фенотипа.