Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

Общая цель этого метода заключается в быстром скрининге аутоантител мультиплексным способом. Этот метод может помочь выявить ключевые вопросы в области аутоиммунитета, например, какие аутоантитела коррелируют с различными болезненными состояниями. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что аутоантитела могут быть проверены параллельным образом, нужны только микролитры сыворотки, а антигена — только микрограммы.

Чтобы создать антигенные микрочипы, начните с разбавления антигенов в PBS до конечной концентрации 2 миллиграмма на миллилитр. Настройте конфигурацию микромассива с девятью контактами для печати до 162 уникальных антигенов в двух экземплярах. Включите антигены IgG и IgM в библиотеку антигенов в качестве положительного контроля.

Включайте PBS только в качестве отрицательного контроля. Добавьте по 20 микролитров каждого антигена в исходную пластину на 384 лунки группами, которые отражают настройку печатающей головки. Используйте фольгу, чтобы покрыть исходную пластину, и заморозьте пластину при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока массивы не будут готовы к печати.

Очистите твердые контакты микрочипа, инкубировав их в ультразвуковой ванне с деионизированной водой три раза по одной минуте каждый. Поместите штифты в решетку для просушки. Затем расположите контакты в печатающей головке микрочипа.

Для девяти контактов используйте конфигурацию три на три. Затем запрограммируйте микромассив для тиража, установив количество контактов на печатающей головке, количество слайдов для печати, количество контактных площадок на каждом слайде и количество повторяющихся пятен для каждого антигена. Кроме того, запрограммируйте микрочипер на ультразвуковую обработку контактов в воде между различными группами антигенов.

Затем, после размораживания исходной пластины, центрифугируйте ее в течение одной минуты при 100-кратном G. Поместите исходную пластину в указанное место в микромассиве, затем удалите участок фольги, который покрывает первую группу антигенов, которые должны быть напечатаны. Расположите ненапечатанные слайды на поверхности устройства для распечатывания и запустите программу печати. Печатайте слайды при комнатной температуре при влажности, установленной на массиве от 55 до 60%После того, как каждая группа антигенов будет напечатана на всех слайдах, приостановите работу микромассива.

Накройте только что напечатанные антигены фольгой, чтобы предотвратить испарение, и обнажите следующую группу антигенов, которые будут напечатаны. Затем продолжите программу печати. После того, как все антигены будут напечатаны, накройте исходную пластину новым куском фольги, и заморозьте ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Поместите напечатанные слайды в коробку для слайдов и запечатайте ее вакуумом. Слайды можно использовать на следующий день или через месяц. Для зондирования микрочипов с разбавленными сыворотками с помощью инкубационных камер поместите предметные стекла в рамки.

Затем добавьте по 700 микролитров блокирующего буфера на каждую поверхность массива. Поместите клейкую пленку на раму и переложите ее в герметичную емкость с кусочком влажной ткани. Затем инкубируйте горки при температуре четыре градуса Цельсия на коромысле на ночь.

На следующий день разбавьте образцы сыворотки в соотношении один к 100 в блокирующем буфере. Затем отсасывайте блокирующий раствор из массивов и добавляйте по 500 микролитров разведенного образца на каждую поверхность массива. Далее накрываем массивы липкой пленкой, и выдерживаем при температуре четыре градуса Цельсия, с покачиванием в течение одного часа.

Затем отсасывайте образцы сыворотки из массивов и используйте буфер для промывки поверхностей массива четыре раза, вылив буфер на предметные стекла и быстро смахнув его. Используйте 700 микролитров блокирующего буфера для промывки каждой поверхности массива и инкубируйте 10 минут при комнатной температуре с покачиванием. Затем добавьте 500 микролитров разведенного вторичного антитела на каждую поверхность предметного стекла и накройте ее клейкой пленкой.

Инкубируйте горки при температуре четыре градуса Цельсия с покачиванием в течение 45 минут. После инкубации аспирируйте вторичную смесь антител из предметных стекол и промойте четыре раза, как показано только что. Затем промойте предметные стекла 700 микролитрами буфера для блокирующего разведения, три раза по 10 минут каждый.

Снимите слайды с рамок, затем поместите их в металлическую решетку для слайдов и погрузите в PBS. Инкубировать при комнатной температуре с орбитальным встряхиванием в течение 20 минут. Поместите решетку для слайдов в емкость с деионизированной водой на 15 секунд.

Затем поместите решетку в новую емкость с водой, и инкубируйте еще 15 секунд. Чтобы высушить предметные стекла, поместите решетку для слайдов на адаптер для пластин ELISA в центрифуге и вращайте при температуре 220 раз больше G и комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите предметные стекла в светоплотную коробку до тех пор, пока они не будут готовы к сканированию.

Для сканирования предметных стекол используйте микрочиповый сканер, который может обнаруживать флуоресцентные сигналы СИ три и СИ пять. Определите оптимальные настройки мультипликаторной трубки или ФЭУ путем предварительного сканирования полного слайда библиотеки антигенов, который был исследован только вторичными антителами. Установите используемые значения ФЭУ нажатием аппаратной кнопки таким образом, чтобы человеческие признаки IgG на трехканальном канале СИ и человеческие признаки IGM на пятиканальном канале СИ имели одинаковую медианную интенсивность флуоресценции за вычетом фона, или MFIB, которая обычно составляет 40 000.

Далее отсканируйте экспериментальные слайды по двум каналам, нажав кнопку сканирования. Сохраняйте изображения слайдов в обоих каналах после каждого сканирования. С помощью кнопки «Файл» загрузите анализируемый слайд в программное обеспечение микрочипа.

Затем используйте кнопку «Файл» для загрузки списка массивов генов или файла GAL, который содержит макет массива, с идентичностями признаков массива. Поместите шаблон массива поверх отсканированного изображения так, чтобы функции массивов как можно точнее соответствовали шаблону. Нажмите кнопку выравнивания, чтобы выровнять объекты во всех блоках по шаблону.

Затем программное обеспечение рассчитывает MFI минус фон для каждого из антигенов. Наконец, используйте кнопку «Файл», чтобы экспортировать результаты в виде текстового файла и проанализировать данные в соответствии с текстовым протоколом. На этом рисунке, показывающем положительные и отрицательные контрольные слайды, отрицательное стекло прощупывают только вторичными антителами, а положительное контрольное стекло зондируют сывороткой крови пациента с системной красной волчанкой.

Как указано здесь, положительная контрольная сыворотка с известной реактивностью к рибоП содержит антитела IgM против одноцепочечной ДНК и антитела IgG против рибоП. Линейные ответы наблюдались при использовании IgM во всех разведениях сыворотки и при IgG до МФИ минус фон приблизительно 30 000. В этом эксперименте массив исследован с человеческой сывороткой пациента с криоглобулинемическим васкулитом, с документально подтвержденным ревматоидным фактором, который представляет собой антитело IgM против IgG.

Особенность IgG является желто-зеленой из-за связывания IgM в сыворотке крови пациента с иммобилизованным IgG на матрице. При использовании только вторичных антител не наблюдается реактивности IgM против IgG, обнаруженных на матрице. На рисунке показаны мышиные IgM и IgG, обнаруженные на матрице, которые обнаруживаются только с помощью вторичных антител к IgM и IgG соответственно.

На этом рисунке показано выравнивание сетки шаблона на отсканированном изображении матрицы с помощью программного обеспечения для анализа микрочипов. После выравнивания объекты массива могут быть проанализированы для получения медианы интенсивности флуоресценции минус фон для каждого объекта. После освоения зондирование антигенных микрочипов может быть выполнено за четыре часа, если оно выполнено правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ИФА, для валидации результатов, полученных с помощью антигенных микрочипов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как печатать антигенные микрочипы, как зондировать антигенные микрочипы сывороткой и как сканировать антигенные микрочипы с помощью сканера. Не стоит забывать, что работа с сывороткой крови человека может быть опасной, и при выполнении этой процедуры следует соблюдать универсальные меры предосторожности.