Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

Общая цель данного метода заключается в быстром мультиплексном скрининге аутоантител. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области аутоиммунитета, например, определить, какие аутоантитела коррелируют с различными патологическими состояниями. Основными преимуществами данной методики являются возможность параллетного скрининга аутоантител, необходимость использования лишь микролитров сыворотки и микрограммов антигена.

Для создания антигенных микромассивов начните с разведения антигенов в PBS до конечной концентрации 2 mg/mL. Настройте конфигурацию микродиспенсера с девятью пинами для нанесения до 162 уникальных антигенов в двух повторностях. Включите антигены IgG и IgM в библиотеку антигенов в качестве положительных контролей.

В качестве отрицательного контроля используйте только PBS. Добавьте по 20 µL каждого антигена в исходный планшет на 384 лунки группами, соответствующими конфигурации печатающей головки. Накройте исходный планшет фольгой и заморозьте его при температуре -80 °C до начала печати массивов.

Очистите контакты твердофазного микромассива, трижды инкубируя их в ультразвуковой ванне с деионизированной водой по одной минуте за каждый цикл. Поместите контакты в стойку для высыхания. Затем установите контакты в печатающую головку микромассива.

Для девяти пинов используйте конфигурацию 3x3. Затем запрограммируйте микроматрикатор для выполнения печати, установив количество пинов на печатающей головке, количество слайдов для печати, количество площадок на каждом слайде и количество повторов пятен для каждого антигена. Кроме того, настройте микроматрикатор на ультразвуковую очистку пинов в воде между разными группами антигенов.

Затем, после размораживания исходного планшета, центрифугируйте его в течение одной минуты при 100 ×g. Поместите исходный планшет в соответствующий слот микроматрицера, затем удалите участок фольги, закрывающий первую группу антигенов для печати. Расположите непечатные предметные стекла на поверхности прибора и запустите программу печати. Печать стекол следует проводить при комнатной температуре, установив влажность на микроматрицере в пределах 55–60%. После печати каждой группы антигенов на всех стеклах приостановите работу микроматрицера.

Накройте только что нанесенные антигены фольгой для предотвращения испарения и откройте следующую группу антигенов для нанесения. Затем продолжите программу печати. После нанесения всех антигенов накройте исходный планшет новым листом фольги и заморозьте его при температуре минус 80 °C.

Поместите распечатанные предметные стекла в контейнер для стекол и завакуумируйте его. Стеклами можно воспользоваться на следующий день или в течение одного месяца. Для зондирования микрочипов разбавленной сывороткой с использованием инкубационных камер поместите стекла в рамки.

Затем добавьте по 700 мкл блокирующего буфера на поверхность каждого массива. Накройте рамку адгезивной пленкой и перенесите ее в герметичный контейнер с кусочком влажной салфетки. После этого инкубируйте слайды при температуре четыре °C на ротаторе в течение ночи.

На следующий день разведите образцы сыворотки в соотношении 1:100 в блокирующем буфере. Затем удалите блокирующий раствор из массивов и добавьте 500 µL разведенного образца на поверхность каждого массива. Далее накройте массивы адгезивной пленкой и инкубируйте при температуре 4 °C в течение одного часа при постоянном перемешивании на шейкере.

Затем аспирируйте образцы сыворотки из массивов и четыре раза промойте поверхности массивов промывочным буфером, наливая буфер на предметные стекла и быстро сливая его. Используйте 700 мкл блокирующего буфера для промывки каждой поверхности массива и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре с перемешиванием на качалке. Затем добавьте 500 мкл разведенных вторичных антител на поверхность каждого стекла и накройте их адгезионной пленкой.

Инкубируйте предметные стекла при температуре 4 °C в течение 45 минут на качалке. После инкубации удалите смесь вторичных антител с предметных стекол аспирацией и промойте их четыре раза, как было показано ранее. Затем промойте стекла 700 µL блокирующего разбавляющего буфера трижды по 10 минут.

Извлеките предметные стекла из рамок, поместите их в металлическую кассету для стекол и погрузите в PBS. Инкубируйте при комнатной температуре с орбитальным встряхиванием в течение 20 минут. Поместите кассету со стеклами в контейнер с деионизированной водой на 15 секунд.

Затем поместите штатив в новый контейнер с водой и инкубируйте еще 15 секунд. Для высушивания предметных стекол поместите штатив на адаптер для планшетов ELISA в центрифуге и центрифугируйте при 220 ×g и комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите предметные стекла в светонепроницаемый бокс до начала сканирования.

Для сканирования слайдов используйте микроматричный сканер, способный детектировать флуоресцентные сигналы SI three и SI five. Определите оптимальные настройки фотоэлектронного умножителя (ФЭУ), предварительно просканировав слайд с полной библиотекой антигенов, который был инкубирован только со вторичными антителами. Установите значения ФЭУ с помощью аппаратной кнопки так, чтобы признаки человеческого IgG в канале SI three и признаки человеческого IGM в канале SI five имели схожую медианную интенсивность флуоресценции за вычетом фона (MFIB), которая обычно составляет 40 000.

Затем просканируйте экспериментальные предметные стекла в двух каналах, нажав кнопку сканирования. Сохраняйте изображения стекол в обоих каналах после каждого сканирования. С помощью кнопки файла загрузите стекло, предназначенное для анализа, в программное обеспечение для микрочипов.

Затем с помощью кнопки выбора файла загрузите список генов матрицы (файл GAL), содержащий схему расположения элементов матрицы и идентификаторы этих элементов. Наложите шаблон матрицы на отсканированное изображение так, чтобы элементы матрицы максимально точно совпадали с шаблоном. Нажмите кнопку выравнивания, чтобы совместить элементы во всех блоках с шаблоном.

Затем программное обеспечение вычислит MFI за вычетом фона для каждого из антигенов. Наконец, используйте кнопку файла для экспорта результатов в виде текстового файла и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. На данном рисунке, демонстрирующем слайды с положительным и отрицательным контролем, отрицательный слайд обработан только вторичными антителами, а слайд положительного контроля — сывороткой пациента с системной красной волчанкой.

Как показано здесь, сыворотка положительного контроля с известной реактивностью к riboP содержит антитела IgM к одноцепочечной ДНК и антитела IgG к riboP. Линейный ответ наблюдался для IgM при всех разведениях сыворотки, а для IgG — до значения MFI за вычетом фона приблизительно 30 000. В данном эксперименте массив исследуется с использованием сыворотки человека, полученной от пациента с криоглобулинемическим васкулитом и подтвержденным ревматоидным фактором, который представляет собой антитело IgM к IgG.

Окраска зоны IgG желто-зеленая из-за связывания IgM из сыворотки пациента с иммобилизованным IgG на матрице. При использовании только вторичных антител реактивность IgM в отношении нанесенного на матрицу IgG не наблюдается. Здесь показано, что мышиные IgM и IgG, нанесенные на матрицу, детектируются только с помощью антимышиных вторичных антител к IgM и IgG соответственно.

На этом рисунке показано совмещение шаблонной сетки с отсканированным изображением микрочипа с помощью программного обеспечения для анализа микрочипов. После совмещения можно проанализировать элементы микрочипа для получения медианной интенсивности флуоресценции за вычетом фона для каждого элемента. При должном навыке и правильном выполнении процедур зондирование антигенных микрочипов может быть осуществлено за четыре часа.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как ELISA, для валидации результатов, полученных с помощью микромассивов антигенов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как печатать микромассивы антигенов, как проводить гибридизацию микромассивов антигенов с сывороткой и как сканировать микромассивы антигенов с помощью сканера. Не забывайте, что работа с сывороткой крови человека может быть опасна, поэтому при выполнении данной процедуры следует соблюдать универсальные меры предосторожности.