Использование противовоздушного антигена Microarray для измерения широты сывороточных антител через вирус подтипы

Микроаррей антигена гриппа позволяет одновременно измерять несколько изотипов антител против более чем 300 штаммов гриппа из небольшого объема образца крови всего одного микролитора. Микроаррей облегчает высокопропутное измерение широты антител к гриппу в антигенном ландшафте штаммов гриппа. Характеризовав антитела гриппа более подробно, чем это было возможно ранее, этот микроаррей может помочь определить, почему у некоторых людей развивается инфекция гриппа, а у других нет.

Метод антигенного микроаррея был применен к 35 различным патогенам в нашей лаборатории, что позволяет измерять антитела против 60 000 антигенных мишеней и от 50 000 образцов сыворотки, собранных из случаев инфекционных заболеваний и здорового контроля во всем мире. Обустив эту технику через сша семинары, мы обнаружили, что возможность визуально продемонстрировать технику имеет решающее значение для ее понимания и производительности. Демонстрацией процедуры будут Аль-Ясинскас и Рафаэль де Ассис, ученые проекта из нашей лаборатории.

Для печати антигенов с помощью принтера microarray, выберите принтер с низким объемом microarray кровянистые пятна булавки, которые могут аспирировать антигены из 384-хорошо источник пластины в образец канала и депозит антигенов через прямой контакт и капиллярное действие на 16 площадку нитроцеллюлозы покрытием стеклянные слайды. В программном обеспечении для печати введите количество образцов пластин, которые будут использоваться в номере текстового ящика пластин, и выберите тип пластины, который будет использоваться для анализа. Выберите конфигурацию пин-кода и установите происхождение смещения на расстояния между происхождением слайда и местом, где печатные штыри начнут печатать на слайдах.

В соответствии с вкладкой проектирования массива определите размер и форму массивов и выберите параметры того, как печатные штыри будут подбирать и распределять образцы. Настройте протоколы очистки штыря и определения последовательности, в которой блоки образца печатаются на слайдах. Программное обеспечение массива будет строить аннотированный файл индекса сетки, чтобы описать расположение антигенов в каждом микроармей.

После программирования печатного программного обеспечения с желаемым протоколом, запустите тираж. После завершения, место unprobed microarray слайды в светозащитной коробке в desiccator шкаф при комнатной температуре. Чтобы исследовать серу для антител на microarray, используйте клипы, чтобы прикрепить microarray слайды площадку сторону вверх на зондирующие камеры и поместить камеры в кадрах.

Будьте осторожны при сборке слайдов, так как они легко ломаются и проверяют на наличие утечек после регидратации. При необходимости разобрать и собрать слайды, чтобы исправить утечки. Увлажнить слайды 100 микролитров фильтрованного блокирующего буфера на колодец и разбавить серу в соотношении 1 к 100 в 100 микролитров блокирующего буфера на образец.

Затем инкубировать регидратированные микросхемы и разбавленную сыворотку в течение 30 минут при комнатной температуре и от 100 до 250 вращений в минуту на орбитальном шейкере. В конце инкубации используйте наконечники пипеток, подключенные к вакуумной линии со вторичной колбой для сбора, чтобы тщательно аспирировать блокирующий буфер из угла каждой камеры, не касаясь колодок, и немедленно добавить разбавленную сыворотку в прокладки, не позволяя прокладкам высохнуть. Затем поместите покрытые рамы в лотки, содержащие влажные бумажные полотенца запечатаны для поддержания влажности и инкубировать кадры на ночь при четырех градусах по Цельсию на качалке.

Для квантовой точки конъюгированных вторичных антител маркировки, тщательно аспирировать сыворотки, как только что продемонстрировали и промыть слайды с тремя моет в 100 микролитров свежего буфера TTBS на колодец в течение пяти минут каждый на орбитальной шейкер. Слайды затем инкубируется смесью квантовой точки, спрягают вторичные антитела, а затем промывают три раза, как описано в протоколе, используя ту же технику, что и только что продемонстрировано. После последней стирки аккуратно удалите горки из камер и аккуратно промойте горки фильтрованной двойной дистиллированной водой, а затем поместите каждую горку в 50-миллилитровую трубку.

Затем высушите горки центрифугой. Чтобы получить изображения слайдов microarray, сначала включите портативный образец и аккуратно поместите слайд, который будет изображен лицом вниз, в держатель слайда в камере визуализации. Откройте программное обеспечение для визуализации и под вкладкой configure Imager выберите соответствующую конфигурацию слайдов.

Под вкладкой управления изображением выберите соответствующий флуоресцентный канал и отрегулируйте время экспозиции и приобретения в зависимости от реактивности сыворотки. Затем нажмите захват, чтобы начать получение изображения. В конце приобретения используйте сетки, ориентированные на фидуциальные маркеры, для обнаружения пятен массива.

Чтобы измерить интенсивность пятна, в панели файловой информации загрузите файл gal и укажите папку, где выводные файлы анализа должны быть сохранены в разделе вариантов анализа. Под вкладкой управления изображением откройте одно из приобретенных изображений для количественной оценки и выберите автоматическое. В разделе анализа массивов создайте фидуциальный шаблон в соответствии с инструкциями программного обеспечения.

Нажмите пакетный анализ, чтобы выбрать папку, которая содержит изображения, которые будут количественно и выбрать fiducial шаблон, который только что был создан. Программное обеспечение будет анализировать каждое изображение и количественно интенсивности пятна. Затем проанализируйте необработанные данные, чтобы сравнить связывание антител между антигенами и образцами сыворотки.

В этом репрезентативном исследовании, вторичные антитела, используемые были Коза анти-человеческой IgG спряженных квантовой точкой, излучающей на 800 нанометров и Коза анти-человеческого IgA спряженных квантовой точкой, излучающей на 585 нанометров для мультиплексного обнаружения igG и IgA антител соответственно. В результирующей тепловой карте были помечены только клинически значимые подтипы с высоким представлением, чтобы сэкономить место со знаком плюс, обозначающим все остальные подтипы большего числа. Сыворотка IgA и IgG были сгруппированы по их гемагглютинин и нейраминидазы молекулярных форм и подтипов.

Продемонстрировать высокую специфичность антител головной группы гемагглютинина для клинических подтипов и высокую перекрестную реактивность цельного гемагглютинина и триамеризированных целых антител гемагглютинина с включением региона запасов. Реакция антител гриппа, измеренная на микроаррее, может быть подтверждена традиционными методами, включая ингибирование гемагглютинации и анализ микронейтрализации. Этот метод дает представление о специфике подтипа антител к группе голов гриппа и относительной важности антител IgA и IgG к восприимчивости к гриппу.

Хотя ни одно из материалов не является чрезвычайно опасным, все образцы сыворотки человека должны обрабатываться в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности.