Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции

Общая цель данной процедуры — оценка фагоцитарной функции микроглии сетчатки in vivo. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, например, изменяют ли определенные соединения фагоцитарную функцию микроглии в физиологических условиях. Основным преимуществом данной методики является использование проточной цитометрии, что обеспечивает быстрый и точный количественный анализ фагоцитоза микроглии.

В демонстрации процедуры мне будет помогать Сусуму Сакимото, постдок из моей лаборатории. Начните с того, что наберите в шприц с иглой 33-го калибра 0,5 µl раствора частиц с флуоресцентной меткой. Затем поместите анестезированную мышь на бок на мягкий материал под хирургическим микроскопом и подтвердите достаточный уровень седации, убедившись в отсутствии реакции на щипок за палец на лапке.

Затем с помощью пинцета осторожно надавите вокруг одного века, чтобы глазное яблоко слегка вышло из глазницы. После этого захватите голову двумя пальцами чуть выше уха и за челюсть животного, и аккуратно натяните кожу параллельно векам, чтобы глаз оставался слегка выпяченным из глазницы. Интравитреальные инъекции являются сложной процедурой, и их неправильное выполнение приведет к смещенным и вариативным результатам.

Чтобы уменьшить травматизацию глаза, удерживайте животное в стабильном положении, сводя к минимуму движения головы. Чтобы проколоть глазное яблоко, аккуратно зафиксируйте мышь одной рукой. Затем найдите лимб роговицы в месте соединения роговицы и склеры; у пигментированных мышей он виден как серое кольцо.

Удерживая шприц в другой руке, введите иглу в лимбус. Затем слегка вытяните иглу, чтобы удалить небольшой объем стекловидного тела, и медленно нажмите на поршень для введения частиц. После введения всех микросфер медленно извлеките шприц, чтобы избежать рефлюкса введенного материала, и закапайте увлажняющие капли, чтобы поддерживать увлажненность глаза после того, как он вернется в исходное положение.

Затем поместите животное в отдельную клетку на грелку и наблюдайте за ним до полного восстановления. Через три часа после интравитреальной инъекции, используя пинцет под углом 45 градусов, осторожно надавите на веко, чтобы вызвать проптоз глазного яблока. Поместите пинцет за глазное яблоко и потяните.

Затем под диссекционным микроскопом перенесите глазное яблоко на сухую область чашки Петри, содержащей небольшой объем PBS с кальцием и магнием. С помощью одного конца супертонких пинцетов проколите глаз в области лимба роговицы. Далее, удерживая глазное яблоко тонкими пинцетами с углом 45 градусов, с помощью пружинных ножниц сделайте разрез по краю лимба роговицы примерно до половины окружности.

Перенесите глазное яблоко в PBS и с помощью второй пары тонких угловых пинцетов (45 градусов) отделите роговицу от склеры. Хрусталик и сетчатка извлекутся в целости. Убедитесь, что хрусталик и сетчатка отделены друг от друга, и перенесите сетчатку в полистирольную пробирку объемом 5,4 миллилитра, содержащую два миллилитра PBS с кальцием и магнием.

Для получения суспензии одиночных клеток сетчатки используйте набор для диссоциации нейронной ткани согласно инструкциям производителя и ресуспендируйте клетки в 200 µL окрашивающего буфера. Затем перенесите образец в одну лунку U-образного 96-луночного планшета. После центрифугирования переверните планшет, чтобы удалить супернатант, и заблокируйте FC-рецепторы, добавив в каждую лунку 25 µL окрашивающего буфера, содержащего антитела к CD16 и CD32, на пять минут при комнатной температуре.

Затем проведите маркировку клеток с помощью соответствующих антител в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После этого центрифугируйте клетки для получения осадка и промойте их 200 мкл свежего буфера для окрашивания на каждую лунку. Теперь ресуспендируйте осадки в 200 мкл буфера для окрашивания с добавлением красителя жизнеспособности и перенесите образцы в микротитрованные пробирки объемом 1,2 мл.

Затем промойте лунки дополнительными 100 µL буфера для окрашивания и красителя жизнеспособности, объединив промывочные растворы с соответствующими образцами для анализа методом проточной цитометрии. Этот метод можно использовать для постнатальных мышей в возрасте от 10 до 20 дней или для взрослых мышей; также его можно адаптировать для изучения влияния соединений и/или генетических манипуляций на фагоцитоз микроглии. Например, в данном эксперименте после внутрибрюшинного введения различных доз LPS было определено, что доза LPS 1,42 mg/kg вызывает статистически значимое увеличение процента фагоцитирующей микроглии по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо.

После освоения эта методика может быть выполнена за шесть часов при условии правильного соблюдения всех этапов. После данной процедуры можно использовать другие методы, такие как сортировка клеток с последующим проведением qPCR или протеомного анализа, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о различиях между фагоцитирующей и нефагоцитирующей микроглией сетчатки. Мы ожидаем, что разработка данной методики позволит специалистам в области офтальмологии и нейробиологии в дальнейшем исследовать фагоцитарную функцию микроглии in situ и в физиологически релевантном контексте.