Проточная цитометрия и анализ одиночных клеток для характеристики активации микроглии в раннем постнатальном развитии мозга мышей

Наше исследование изучает, как микроглия влияет на восстановление мозга после пренатальной черепно-мозговой травмы. И мы стремимся определить, может ли модулирование активности микроглиальных клеток улучшить долгосрочные неврологические результаты. Я считаю, что дело в сложности реакций микроглиальных клеток и проблемах описания этих реакций наиболее точным образом, чтобы представить физиологические, а также патологические реакции и заболевания.

Мы используем различные методы, такие как секвенирование РНК одиночных клеток и эксперименты с проточной цитометрией, для характеристики микроглиальных состояний и функций развивающегося мозга после пренатальной травмы. Основной проблемой является сохранение жизнеспособности клеток и идентичности микроглии во время изоляции, особенно в неонатальные моменты, когда количество клеток мозжечка ограничено. Это поднимает вопросы о том, как повреждения мозжечка в раннем возрасте приводят к транскрипционным изменениям в субпопуляции микроглии и как таргетная терапия может модулировать эти изменения.

Для начала при необходимости препарируйте конкретную область мозга мышей. С помощью щипцов перенесите ткань в небольшую чашку Петри, содержащую микроглиальную среду для культивирования клеток, помещенную на лед для поддержания жизнеспособности клеток. С помощью пипетки удалите питательную среду микроглиальных клеток из чашки Петри.

Затем с помощью скальпеля тонко разрежьте мозговую ткань в той же чашке Петри. Перенесите гомогенизированную мозговую ткань в пятимиллилитровые пробирки для ферментативного пищеварения. Добавьте по два миллилитра сбалансированного солевого раствора Hanks'Balanced Salt Solution с добавлением коллагеназы D и DNase 1 в каждую пробирку и плотно запечатайте крышки парапленкой.

Затем инкубируйте трубки на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, встряхивая их каждые пять минут. Чтобы остановить пищеварение, поместите трубки на лед. Затем пропустите гомогенат через фильтр с металлической сеткой толщиной 140 микрометров, чтобы удалить крупный мусор.

С помощью стеклянного пестика аккуратно диссоциируйте оставшиеся ячейки на фильтре. Промойте металлический сетчатый фильтр несколько раз тремя миллилитрами среды для культивирования микроглиальных клеток для каждой промывки. Теперь с помощью 10-миллилитровой пипетки соберите фильтрат и перенесите его в 15-миллилитровую пробирку.

Затем центрифугируйте пробирку при 500 г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. После этого осторожно переверните трубку, чтобы сбросить надосадочную жидкость. С помощью решетки аккуратно соскребите трубку, чтобы снова суспендировать гранулу.

Затем добавьте 10 миллилитров 37% раствора коллоидной среды на основе диоксида кремния к ресуспензионным клеткам. Центрифугируйте раствор при 500г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия с минимальным усилием разрыва. С помощью 10-миллилитровой пипетки отсасывайте слой миелина из верхней части раствора.

Чтобы промыть клетки, добавьте 10 миллилитров сбалансированного солевого раствора Хэнкса и центрифугируйте пробирку при плотности 500 г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости и повторного суспендирования гранулы добавьте в пробирку 10 миллилитров буфера для сортировки флуоресцентно-активированных клеток. После центрифугирования суспендируйте последнюю гранулу в оставшемся буфере для последующего применения.

Перенесите все изолированные клетки в 96-луночный планшет с коническим дном. Центрифугируйте планшет при 500г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Быстро переверните пластину одним движением, чтобы избавиться от надосадочной жидкости.

Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 25 микролитрах блокирующего раствора, и инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 15 минут. Для приготовления смеси для окрашивания внеклеточными антителами центрифугируйте пробирки с антителами при плотности 10 000 г для удаления агрегатов. Не тревожа гранулу, отсасывайте необходимый объем из надосадочной жидкости.

Используя буфер для сортировки клеток, активируемый флуоресцентными лампами, отрегулируйте общий объем до 25 микролитров. Теперь добавьте по 25 микролитров смеси для окрашивания внеклеточных антител в каждую лунку и выдержите пластину в течение 20 минут при комнатной температуре. Не перемешивая, добавьте в каждую лунку по 150 микролитров буфера для сортировки клеток, активируемого флуоресцентными лампами.

Центрифугируйте планшет при 500г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем быстро переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера для сортировки клеток, активированного флуоресцентными лампами, и центрифугируйте, как было показано ранее.

Ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах сапонин-параформальдегидного буфера для фиксации и проникновения клеток. Затем выдержите тарелку в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Не перемешивая, добавьте в каждую лунку по 100 микролитров сапонинового буфера.

Центрифугируйте планшет при 500 г в течение шести минут при четырех градусах Цельсия. Затем переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость одним движением, и снова суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера из сапонина. Далее подготовьте компенсационный контроль, добавив 20 микролитров шариков в 11 пустых лунок.

Для приготовления смеси для окрашивания внутриклеточных антител центрифугируйте пробирки с антителами при плотности 10 000 г для удаления потенциальных агрегатов. Не тревожа гранулу, отсасывайте необходимый объем из надосадочной жидкости. Отрегулируйте объем до 50 микролитров с помощью сапонинового буфера.

Затем ресуспендируйте клеточную гранулу в 50 микролитрах внутриклеточной смеси антител. Добавьте по одному микролитру каждого антитела в соответствующие лунки для шариков и инкубируйте планшет в течение 30 минут при комнатной температуре. Не смешивая, добавьте по 150 микролитров буфера из сапонина в каждую лунку, содержащую образцы клеток.

Добавьте 100 микролитров буфера для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток в каждую компенсационную лунку для промывки шариков. После центрифугирования планшета повторно суспендируйте клеточную гранулу и контрольную дозу в 200 микролитрах буфера для сортировки сапонина и буфера для сортировки клеток, активируемых флуоресцентными материалами, соответственно. Центрифугируйте планшет при 500г в течение шести минут при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте образцы клеток и компенсационный контроль в 200 микролитрах буфера для сортировки клеток, активируемого флуоресцентными лампами. Переложите суспензии в помеченные пробирки для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток. Секвенирование РНК одиночных клеток выявило отдельный кластер микроглии, отдельный от других типов клеток мозга, на основе транскрипционных профилей.

Дифференциальный анализ экспрессии выявил значительно повышенную регуляцию генов в микроглии, включая Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 и P2ry12. Микроглиальные клетки были успешно выделены из живых образцов мозга на основе их различной экспрессии маркеров CD45 и CD11b. Различные субпопуляции микроглии были идентифицированы на основе комбинаций маркеров активации, включая CD80, CD86, iNOS, CD206 и Arg1, CD86 и CD64, а также CD163 с CD206.

Экспрессия маркерных генов Ptprc и Itgam была локализована конкретно в микроглиальном кластере в проекции umap, что подтверждает идентичность этих клеток. Анализ графика Скрипки показал более низкую экспрессию противовоспалительных маркеров, таких как Fcgr1 и Cd86, в обработанной микроглии по сравнению с контрольной группой.