Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов
17 ноября 2016 г.
В этой статье описывается количественная оценка гемоцитометра и микрофотографий миграции/инвазии с помощью двух новых плагинов ImageJ с открытым исходным кодом: Калькулятор концентрации клеток и счетчик анализа миграции. Кроме того, в нем описываются протоколы получения изображений и калибровки, а также подробно обсуждаются требования к вводу плагинов.
Общая цель данного протокола заключается в использовании инструментов цифрового анализа для быстрого и точного подсчета клеток в суспензии или при миграции на мембране в анализе инвазии. Данный протокол может помочь исследователям определить количество клеток, необходимое для распространенных методов и анализов подвижности клеток in vitro. Основным преимуществом этого метода является обеспечение быстрого и точного подсчета клеток при наличии множества фильтров и инструментов анализа.
Для начала установите освещение микроскопа на максимум. Переключитесь на объектив 4x и убедитесь, что используются фазово-контрастные фильтры. Затем в программном обеспечении микроскопа установите настройки захвата изображения по умолчанию.
Теперь поместите стандартную камеру Горяева на предметный столик микроскопа и сделайте снимок для этапа калибровки объема изображения. При необходимости отрегулируйте время экспозиции. В программе ImageJ, в разделе калькулятора концентрации клеток, откройте изображение и нажмите кнопку Get Image Dimension.
Это действие заполняет текстовые поля ширины и высоты изображения значением разрешения изображения в пикселях. Затем выберите инструмент «Прямая линия» и, нажимая и перетаскивая курсор, проведите прямую линию по всей длине основного квадрата p гемоцитометра. После этого нажмите клавишу M, чтобы открыть окно с результатами.
Теперь введите значение из столбца length в текстовое поле p-square length в калькуляторе концентрации клеток. Затем нажмите кнопку Calculate Image Volume, чтобы вывести значение объема изображения в текстовое поле image volume. Наконец, нажмите кнопку Save, чтобы завершить калибровку плагина.
Для анализа образца внесите 10 µL клеточной суспензии в обе камеры предметного стекла гемоцитометра и отрегулируйте фокус таким образом, чтобы содержимое клеток было темнее клеточных мембран; это обеспечит фокусировку в центральном сечении клетки, а не на ее полюсах. Затем дополнительно настройте экспозицию, чтобы избежать пересвета клеток. Слабая видимость линий гемоцитометра является допустимой.
Теперь сделайте от пяти до десяти неперекрывающихся снимков центральной области гемоцитометра. Разрешение и увеличение каждого изображения должны быть такими же, как у изображения для калибровки объема. Затем в калькуляторе концентрации клеток нажмите кнопку Count Cells и в появившемся окне выберите папку для подсчета.
Затем в поле ввода количества образцов введите число снимков, сделанных для каждой камеры, и нажмите OK. Теперь плагин начнет сбор данных. Подробности см. в тексте. Для начала в программном обеспечении микроскопа установите настройки захвата изображений по умолчанию.
Для предметного столика стереомикроскопа используйте однотонный белый фон и источник освещения над столиком, предпочтительно два гибких светодиодных светильника. Поместите на столик готовый предметный предмет с мембраной после проведения анализа миграции. Ориентируясь по изображению в реальном времени, выводимому программным обеспечением, вручную отрегулируйте увеличение так, чтобы края одной мембраны находились точно в поле зрения камеры.
Затем отрегулируйте положение источников света и время экспозиции, чтобы максимально точно воспроизвести идеальное изображение, характеризующееся минимальным фоновым цветом и равномерно освещенной мембраной. Точность подсчета клеток зависит от высокого качества полученных изображений.
Поэтому для максимально эффективного использования плагинов важно получить наилучшее изображение, которое позволяет сделать камера пользователя. Теперь извлеките предметное стекло и выполните балансировку белого в программном обеспечении микроскопа, чтобы завершить калибровку. Непосредственно перед съемкой разгладьте каждую мембрану, надавив на покровное стекло, чтобы удалить как можно больше попавших пузырьков воздуха.
Теперь в программном обеспечении установите расположение папки для сохранения снимков. Затем сделайте по одному снимку для каждой мембраны, сохраняя файлы изображений в формате TIF с использованием системы именования sample 001 с последовательным увеличением номера для каждого последующего изображения. Данная система именования необходима для того, чтобы плагин мог найти эти файлы.
Если требуется коррекция плоского поля, для каждого препарата найдите пустую область и сделайте снимок фона. Сохраните файл под именем «sample name blank». Затем в ImageJ откройте плагин TC.
В программе TC нажмите кнопку Flatfield и в диалоговом окне Choose Directory выберите папку, в которой сохранены изображения мембран. Теперь откройте изображение мембраны теста на миграцию и выберите Color Threshold. В открывшемся окне установите метод Shanbhag.
Установите цвет порога на белый. Выберите цветовое пространство RGB и снимите флажок с опции «темный фон» (dark background). Затем установите верхние ползунки на 0, а нижние — на 255, чтобы изображение стало полностью белым.
Когда изображение станет белым, отрегулируйте ползунки зеленого и красного каналов так, чтобы были видны только ядра. В плагине TC скопируйте значения ползунков RGB в соответствующие текстовые поля настроек порога RGB (RGB threshold). Затем нажмите кнопку Add/Modify и перезапишите конфигурацию.
В панели настроек конфигурации нажмите «Save», чтобы сохранить настройки на жестком диске. Теперь, чтобы подсчитать изображения с помощью плагина TC, нажмите «Count Folder» и выберите папку для подсчета. После этого программа обработает изображения и автоматически добавит данные в основную таблицу.
Теперь в основной таблице в столбце «Calibrate?» появится галочка, если изображение отмечено для калибровки на основании его соответствия идеальным метрикам. Выберите все образцы, отмеченные для калибровки.
Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Recount and Suggested Size». Это позволит пересчитать изображения с использованием рекомендуемой минимальной площади частиц. После этого снова щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Show Plot».
Идеальное изображение будет иметь график, напоминающий длинное нормальное распределение с правым хвостом. При необходимости скорректируйте нижний диапазон размера или настройки порога RGB, выбрав образец, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Recount and Manual Settings. Затем введите нужные параметры и нажмите Count, чтобы произвести повторный подсчет на изображении.
Для ручной корректировки подсчета выберите образцы, щелкните правой кнопкой мыши по таблице и выберите Open image with counts. Откроется исходное изображение с красными метками, обозначающими каждую частицу, подсчитанную плагином. Кроме того, можно использовать опцию Show counted binary image, чтобы проверить, насколько хорошо отдельные клетки разделяются при помощи цветового порога.
Чтобы добавить подсчет вручную, удерживайте клавишу Ctrl и нажмите левой кнопкой мыши. В месте курсора будет установлен маркер, который добавится к общему числу. Чтобы вручную удалить маркер, нажмите правой кнопкой мыши по изображению, и плагин удалит маркер, ближайший к курсору.
Чтобы удалить группу маркеров, выберите область интереса и щелкните по ней правой кнопкой мыши, удерживая клавишу Ctrl. Процесс работы калькулятора концентрации клеток зависит от калибровочного изображения p-квадрата, а также от расчета длины p-квадрата и количества пикселей. Объем p-квадрата гемоцитометра составляет 100 нанолитров; исходя из этой константы, общий объем изображения может быть рассчитан после преобразования пикселей в миллиметры.
Сравнение результатов ручного и автоматизированного подсчета по 57 изображениям из различных экспериментов и типов клеток показывает очень тесную корреляцию между обоими методами. Концентрации от пяти миллионов до 2 000 клеток на миллилитр были точно подсчитаны с помощью автоматизированного процесса. Метрика Q представляет общую четкость изображений на основе распределения размеров отдельных частиц.
Адекватное значение Q должно быть больше 0,5. При применении этих критериев к подборке изображений с умеренным и отличным уровнем яркости и фонового шума выяснилось, что количество клеток на калиброванных изображениях было значительно ближе к результатам ручного подсчета, чем на некалиброванных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как точно и эффективно подсчитывать клетки в суспензии и в анализах подвижности клеток с помощью плагинов ImageJ — CCC и TC.
После освоения плагина TC процессы сбора данных, количественного определения и корректировки количества клеток могут быть выполнены менее чем за час. Оба плагина используют функцию подсчета частиц из ImageJ и могут быть модифицированы путем редактирования макросов ImageJ. Это предоставляет пользователю большую гибкость для расширения области применения плагинов на другие типы частиц.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлены новые плагины для ImageJ с открытым исходным кодом — Cell Concentration Calculator и migration assay Counter, предназначенные для количественного анализа микрофотографий гемоцитометра, а также анализов миграции и инвазии. В статье также подробно описаны протоколы получения и калибровки изображений, а также требования к входным данным для работы плагинов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Анализ изображений
Теоретические сведения
- Подсчет клеток имеет важное значение для различных биологических анализов.
- Точный количественный анализ помогает в понимании поведения клеток.
- Инструменты цифрового анализа позволяют повысить эффективность подсчета.
- Инструменты с открытым исходным кодом способствуют доступности исследований.
Цель исследования
- Предложить метод быстрого и точного подсчета клеток.
- Облегчить количественную оценку в анализах подвижности in vitro.
- Описать использование плагинов ImageJ для анализа клеток.
Используемые методы
- Использование плагинов ImageJ для подсчета клеток.
- Получение изображений с помощью микроскопа с фазово-контрастными фильтрами.
- Протоколы калибровки для обеспечения точности измерений.
- Настройка параметров захвата изображений по умолчанию в программном обеспечении микроскопа.
Основные результаты
- Продемонстрирована эффективность плагинов при количественном анализе клеток.
- Представлены подробные протоколы получения изображений.
- Освещены преимущества инструментов цифрового анализа.
- Показано, как обеспечить соответствие входных данных требованиям плагинов.
Выводы
- Новые плагины значительно повышают точность подсчета клеток.
- Они предлагают удобный для пользователя подход для исследователей.
- Цифровые инструменты позволяют оптимизировать рабочие процессы в экспериментах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Автоматизированный подсчет клеток с помощью плагинов ImageJ устраняет критическое узкое место в рабочих процессах высокопроизводительного клеточного анализа, обеспечивая быстрый, воспроизводимый и количественный подсчет клеток. Эта возможность повышает прогностическую достоверность на этапах первичного поиска и скрининга, способствуя получению надежных данных для принятия последующих решений. Данный подход позволяет проводить масштабируемый стандартизированный анализ больших наборов образцов, что напрямую влияет на приоритизацию портфеля проектов и распределение ресурсов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает количественную оценку пролиферации и жизнеспособности клеток для исследований, основанных на проверке гипотез.
- Снижает субъективность и вероятность ручных ошибок при подсчете клеток, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Способствует быстрому получению данных для анализа сигнальных путей и снижения рисков при изучении механизмов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Подготовка валидированного подсчета клеток для анализов миграции и инвазии, обеспечивающая готовность к проведению анализа.
- Стандартизация процедур подсчета, что повышает воспроизводимость и масштабируемость при проведении скринингов.
- Получение количественных данных, подходящих для надежной оценки соединений и сортировки хитов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска in vitro до выбора доклинической модели за счет надежного количественного определения клеток.
- Позволяет согласовывать результаты клеточных анализов со стратегиями трансляционных биомаркеров в соответствующих случаях.
- Оптимизирует принятие решений о продвижении разработки с учетом рисков благодаря получению согласованных высококачественных данных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Автоматизированный подсчет клеток интегрируется на стыке этапов первичного поиска, скрининга и доклинических исследований, обеспечивая возможность многократного использования аналитических инструментов для клеточных анализов.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей за счет обеспечения точного количественного определения клеток.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимость анализа и получение количественных данных для тестов на миграцию/инвазию и пролиферацию.
- Аналитика: Предоставляет статистические данные и калибровочные показатели для объективного сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает непрерывность данных для выбора доклинических моделей в случаях, когда подсчет клеток является ключевым показателем.
- Корпоративное использование: Предлагает гибкую, модифицируемую платформу для различных нужд по подсчету частиц в разных группах R&D.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность в клеточных анализах.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы подсчета клеток.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок и повышает эффективность использования капитала за счет устранения узких мест, связанных с ручным трудом.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию и продвижение проектов с учетом рисков на основе надежных количественных данных.
Особенности реализации
- Для достижения оптимальных результатов требуются экспертные знания в области микроскопии и цифрового получения изображений.
- Зависит от наличия фазово-контрастных микроскопов и совместимой инфраструктуры для визуализации.
- Требует межкомандной стандартизации протоколов захвата изображений и калибровки.
- Метод адаптируем к различным типам клеток и форматам анализа при внесении соответствующих модификаций в макросы.
- Качество изображений и точность калибровки имеют решающее значение для надежности автоматического подсчета.
