Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов

Общая цель этого протокола заключается в использовании инструментов цифрового анализа для быстрого проведения точного подсчета клеток в суспензии или на миграции в мембране для инвазионного анализа. Этот протокол может помочь исследователям количественно определить количество клеток, необходимое для распространенных методов и анализов подвижности клеток in vitro. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает быстрый и точный подсчет клеток, а также включает в себя несколько фильтров и инструментов анализа.

Для начала установите подсветку микроскопа на максимум. Переключитесь на объектив 4x и убедитесь, что фазово-контрастные фильтры используются. Затем в программном обеспечении микроскопа установите для настроек захвата изображений значения по умолчанию.

Теперь поместите стандартный гемоцитометр на предметный столик микроскопа и сделайте снимок для этапа калибровки объема изображения. При необходимости отрегулируйте время экспозиции. В ImageJ под калькулятором концентрации клеток откройте изображение и нажмите кнопку «Получить размер изображения».

Это действие заполняет текстовые поля ширины и высоты изображения разрешением изображения в пикселях. Затем выберите инструмент «Прямая линия» и проведите прямую линию по всей длине основного p-квадрата гемоцитометра, щелкнув и перетащив курсор. Затем нажмите клавишу M, чтобы отобразить окно результатов.

Теперь введите значение из столбца длины в текстовое поле p-квадратной длины в калькуляторе концентрации клеток. Затем нажмите кнопку «Рассчитать объем изображения», чтобы вывести объем изображения в текстовое поле объема изображения. Наконец, нажмите кнопку «Сохранить», чтобы завершить калибровку плагина.

Для анализа образца загрузите 10 микролитров клеток в обе камеры предметного стекла гемоцитометра и отрегулируйте фокус таким образом, чтобы внутренняя часть клеток была темнее клеточной мембраны, чтобы обеспечить фокус в центральном поперечном сечении клетки, а не на полюсах. Затем дополнительно отрегулируйте экспозицию, чтобы клетки не были переэкспонированы. Допустимы слабо заметные линии гемоцитометра.

Теперь сделайте от пяти до десяти неперекрывающихся изображений центральной области гемоцитометра. Разрешение и увеличение каждого изображения должны быть такими же, как и для изображения объемной калибровки. Далее в калькуляторе концентрации клеток нажмите на «Подсчитать ячейки» и во всплывающем окне выберите папку для подсчета.

Затем в поле ввода номера образца введите количество изображений, сделанных в каждой камере, и нажмите OK. Теперь плагин будет собирать данные. Подробнее см. в тексте. Для начала в программном обеспечении микроскопа установите для настроек захвата изображений значения по умолчанию.

Для сцены рассекающего прицела используйте сплошной белый фон и используйте источник света над сценой, желательно два гибких светодиодных светильника. Теперь поместите на сцену готовое предметное стекло для миграционного анализа. Глядя на изображение в реальном времени, отображаемое программным обеспечением, вручную отрегулируйте увеличение так, чтобы края одной мембраны находились в поле зрения камеры.

Затем отрегулируйте положение источников света и время экспозиции, чтобы как можно точнее воспроизвести идеальное изображение. Который имеет минимальный цвет фона и равномерно подсвеченную мембрану. Точность подсчета клеток зависит от высокого качества получения изображений.

Поэтому важно получить наилучшее изображение, достижимое камерой пользователя, для наиболее эффективного использования плагинов. Теперь снимите предметное стекло и сбалансируйте белое изображение в программном обеспечении микроскопа, чтобы завершить калибровку. Непосредственно перед визуализацией расплющите каждую мембрану, надавливая на покровное стекло, чтобы удалить как можно больше захваченных пузырьков.

Теперь в программном обеспечении установите местоположение папки захвата. Затем захватите по одному изображению на каждой мембране, сохранив файлы изображений в виде TIF с использованием соглашения об именовании образца 001 с постепенным увеличением числа для каждого изображения. Это соглашение об именовании необходимо для того, чтобы плагин мог найти файлы.

Если требуется коррекция плоского поля, для каждого слайда найдите пустую область и возьмите пустое изображение. Сохраните файл в качестве пустого образца имени. Далее в ImageJ откройте плагин TC.

В TC нажмите кнопку Flatfield и в диалоговом окне Choose Directory выберите папку, в которой были сохранены изображения мембраны. Теперь откройте изображение мембраны для анализа миграции и выберите «Порог цвета». В окне установите метод на Shanbhag.

Установите цвет порога на белый. Установите цветовое пространство на RGB и снимите галочку с опции темного фона. Затем установите верхние ползунки на ноль, а нижние ползунки на 255, чтобы изображение стало полностью белым.

Когда цвет станет белым, отрегулируйте зеленый и красный ползунки, пока не будут видны только ядра. В плагине TC скопируйте значения ползунков RGB в соответствующие текстовые поля пороговых значений RGB. Затем нажмите кнопку «Добавить/Изменить» и перезапишите конфигурацию.

На панели настроек конфигурации нажмите кнопку Сохранить, чтобы записать настройки на жесткий диск. Теперь, чтобы подсчитать изображения с помощью плагина TC, нажмите на «Подсчитать папку» и выберите папку для подсчета. Затем программа обработает изображения и автоматически добавит данные в основную таблицу.

Теперь в главной таблице будет стоять галочка в поле Калибровать? Столбец, если на изображении помечен для калибровки на основе его сходства с идеальными метриками. Выберите все образцы, помеченные для калибровки.

Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Пересчет и предложенный размер». Это приведет к подсчету изображений с рекомендуемой минимальной площадью частиц. Затем щелкните правой кнопкой мыши еще раз и выберите «Показать график».

Идеальное изображение должно иметь график, напоминающий длинное правохвостое нормальное распределение. При необходимости отрегулируйте нижний диапазон размеров или пороговые значения RGB, выбрав образец, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Пересчет и ручные настройки». Затем введите нужные настройки и нажмите «Подсчитать», чтобы пересчитать изображение.

Чтобы настроить счетчики вручную, выберите выборки, щелкните таблицу правой кнопкой мыши и выберите «Открыть изображение с счетчиками». Исходное изображение откроется с красными отметками, которые представляют каждую частицу, подсчитанную плагином. Кроме того, опция Показать подсчитанное двоичное изображение может быть использована для проверки того, насколько хорошо отдельные ячейки разрешаются цветовым порогом.

Чтобы вручную добавить счетчик, удерживайте клавишу Control и щелкните левой кнопкой мыши. Это добавит маркер в месте нахождения курсора, который будет добавлен к общему счету. Чтобы вручную удалить маркер, щелкните правой кнопкой мыши по изображению, и плагин удалит ближайший к курсору маркер.

Чтобы удалить группу маркеров, выберите интересующую область и щелкните ее правой кнопкой мыши, удерживая нажатой клавишу Control. Процесс расчета концентрации клеток зависит от калибровочного изображения p-квадрата и вычисления длины p-квадрата и пикселей. p-квадрат гемоцитометра имеет объем 100 нанолитров, и учитывая эту константу, общий объем изображения можно рассчитать после преобразования пикселей в миллиметры.

Сравнение ручных и автоматических подсчетов на 57 изображениях из различных экспериментов и типов клеток показывает, что существует очень тесная корреляция между обоими методами. Концентрации от пяти миллионов до 2000 клеток на миллилитр были точно подсчитаны с помощью автоматизированного процесса. Метрика Q представляет собой общую четкость изображения, основанную на распределении частиц различных размеров.

Адекватное значение Q больше 0,5. Применяя эти квалификаторы к выборке изображений от скромных до отличных с точки зрения яркости и фонового шума, количество откалиброванных изображений было значительно ближе к ручному подсчету, чем к некалиброванному количеству изображений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно и эффективно подсчитывать клетки в суспензии и по анализу подвижности клеток с помощью плагинов CCC и TC ImageJ.

После освоения плагина TC, в котором сбор, количественная оценка и корректировка количества клеток могут быть выполнены менее чем за час. Оба плагина основаны на функции подсчета частиц из ImageJ и могут быть изменены путем редактирования макросов, используемых ImageJ. Это обеспечивает большую гибкость для пользователя, чтобы расширить область применения плагинов на другие частицы.