Использование линейных агарозном каналов для изучения Drosophila Личиночная Ползучая Поведение

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за личинками дрозофил, ползающими по линейному агарозному каналу, для изучения развития нейронных цепей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроэтологии и биологии развития, такие как понимание нейронных кодов, которые генерируют двигательные паттерны, и идентификация ключевых генетических и клеточных процессов, которые охватывают нейронные цепи для контроля движения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он ограничивает репертуар поведения личинок, так что исследователи могут детально изучить один мультипаттерн.

Демонстрировать процедуру будет Зарион Маршалл, техник из моей лаборатории. Во-первых, важно оценить состояние здоровья личинки. За три-четыре дня до регистрации замените сборную пластину клетки для взрослых особей.

Приступайте к этому ежедневно и в одно и то же время суток. Посчитайте яйца и только что вылупившихся личинок на тарелке. Ожидаемое количество яиц составляет от 500 до 2 000.

При необходимости отрегулируйте количество взрослых особей в клетке. Мы исследуем планшет через 24 часа, чтобы определить, здоровы ли личинки. Большая часть яиц должна была вылупиться в личинок, а личинки должны были заползти в дрожжевую пасту.

Признаками плохого самочувствия являются большое количество невылупившихся яиц, мертвые тела личинок вдали от дрожжевой пасты, а также личинки с необычно темными пятнами в брюшной полости, что является показателем иммунной реакции. Если личинки выглядят нездоровыми, смените клетку, используя свежеподготовленные пластины, и проверьте генотип взрослой особи. Для эксперимента собирают только что вылупившихся личинок второго возраста с однодневных или двухдневных пластин.

Все эти этапы могут быть использованы в анализе. Для этого протокола необходимо иметь линейный канал PDMS литейной формы. Очистите литейную форму изопропиловым спиртом.

Как только он высохнет, поместите форму в десятисантиметровую крышку или аналогичную емкость. Затем заполните форму трехпроцентной агарозой, охлажденной до 55 градусов Цельсия. Аккуратно вылейте агарозу, чтобы не застрять пузырьки воздуха в форме.

Форма должна быть просто покрыта агарозой. После застывания извлеките из формы агарозные каналы. Обрежьте края каналов в форме диска, а затем погрузите каналы в воду.

Они могут храниться в воде при температуре четыре градуса Цельсия до семи дней. Перед использованием каналов дайте им нагреться до комнатной температуры. Выберите канал, который соответствует ширине личинки.

Ширина каналов варьируется от 100 до 300 микрон, а глубина — 150 микрон. Затем с помощью чистого лезвия бритвы отрежьте один канал от подготовленного диска. С помощью щипцов перенесите канал на стеклянную крышку соответствующего размера, накладку или скольжение рифленой стороной вверх.

Далее с помощью тонких щипцов аккуратно подхватите личинку, не сдавливая ее. Кисть с тонким наконечником также хорошо подойдет. При сжатии болевые рефлексы, такие как перекатывание или сгорбление, могут доминировать в поведении личинки в канале.

Теперь вымойте личинку, ненадолго погрузив ее в воду, а затем поместите ее в отрезанный канал, аккуратно дразня ее на место. Оказавшись в канале, отрегулируйте ориентацию личинки, чтобы интересующую структуру было легко визуализировать. Затем поместите по одной или две капли воды на оба конца канала, чтобы наполнить канал водой.

Если пузырьки воздуха попали в ловушку, осторожно поднимите стенки канала, чтобы удалить их. Чтобы еще больше отрегулировать ориентацию личинки, осторожно подтолкните канал, чтобы покатать личинку. Теперь личинка готова к фотографированию.

Личинки в линейных каналах выполняют продолжительные приступы ритмичного ползания. Флуоресцентные зонды легко исследуются. Например, личинки, экспрессирующие GFP в своих нейронах от драйвера GAL4, демонстрируют динамические изменения интенсивности флуоресценции, исходящей от нервного канатика во время цикла ползания.

ЦНС движется вперед почти в то же время, что и голова и хвост личинки, когда волна мышечного сокращения проходит вдоль оси тела, ЦНС перемещается внутрь и из плоскости фокуса, вызывая изменение флуоресценции нервного канатика. Изменения флуоресценции количественно оценивали по трем шагам ползания для трех личинок. Динамика флуоресценции нервного канатика в течение цикла бега следовала воспроизводимой схеме, которая может быть использована для фенотипирования.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание того, как собирать личинок для поведения, готовить агарозные каналы и загружать личинок в каналы для визуализации линейного поведения ползания. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с личинками.