Два методы, чтобы создать Hypoparathyroid Мыши: паратиреоидэктомию Использование GFP железах и дифтерийно-Токсин-опосредованной паратиреоидного абляции
14 марта 2017 г.
Мыши с приобретенным гипопаратиреозом будут полезны для изучения новых лекарственных методов лечения гипопаратиреоза. Продемонстрированы две процедуры создания таких мышей. Мышь GFP-PTX создается в результате хирургической паратиреоидэктомии под контролем зеленых флуоресцентных паращитовидных желез. Второй, нехирургический подход основан на паращитовидной специфической экспрессии рецептора дифтерийного токсина.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать две мышиные модели приобретенного гипопаратиреоза, которые просты в использовании, дают стабильный фенотип и оставляют функцию щитовидной железы нетронутой. Основное преимущество этих двух моделей заключается в том, что они позволяют точно удалять паращитовидные железы у мышей либо с помощью флуоресцентной хирургии, либо с помощью специфической экспрессии рецептора дифтерийного токсина при ПТГ, что позволяет избирательно нацеливаться на клетки и уничтожать их, не вмешиваясь в соседнюю щитовидную железу. Мы надеемся, что наши мышиные модели смогут ответить на ключевые вопросы в области гипопаратиреоза.
Например, может ли аналог ПТГ помочь поддерживать нормальный уровень кальция в сыворотке крови без увеличения экскреции кальция с мочой? Эти модели также могут быть использованы для изучения других клинических вопросов при гипопаратиреозе. Например, влияет ли гипопаратиреоз на прочность костей и меняется ли она при лечении?
Пациентам трудно ответить на подобные вопросы, но эти модели мышей могут быть использованы для их решения. Начните с обезболивания мышей в возрасте от 8 до 10 недель, экспрессируя GFP конкретно в паращитовидных железах в соответствии с утвержденным протоколом. Уложите животное в положение лежа на спине и обеспечьте соответствующую глубину анестезии за счет отсутствия защемления пальца ноги, рефлекса отмены или других средств.
Продезинфицируйте выбритую кожу с помощью антисептической салфетки с повидон-йодом, а затем подготовьте место разреза с помощью хирургического скраба и ополаскивания спиртом в соответствии с утвержденным протоколом. Далее накройте животное стерильными хирургическими простынями, чтобы уменьшить загрязнение места операции.
После разрезания 2-сантиметрового продольного разреза хирургическим скальпелем используйте изогнутые зубчатые щипцы для рассечения фасции, а слюнные железы отодвигайте в сторону. Затем, рассматривая операционное поле через диссекционный микроскоп, с помощью острых щипцов разрежьте и отделите паратрахеальные мышцы и обнажите трахею. Определите правую и левую доли щитовидной железы, расположенные рядом с трахеей.
Затем переключите источник света на флуоресцентный свет и визуализируйте две зеленые флуоресцентные паращитовидные железы. У грызунов обычно есть только две паращитовидные железы. Если вы не можете идентифицировать две паращитовидные железы рядом со щитовидной железой с каждой стороны, следует заподозрить эктопически расположенные паращитовидные железы и провести тщательный поиск их вдоль трахеи.
Далее с помощью хирургических щипцов и ножниц аккуратно удалите зеленые паращитовидные железы и тщательно проверьте вдоль трахеи, чтобы убедиться, что вся зеленая ткань была удалена. Используйте стерильную марлю для гемостаза. Закройте паратрахеальные мышцы прерывистыми швами.
Закройте разрез кожи швами Холстеда. Поместите послеоперационное животное в отдельную клетку на согревающую подушку для восстановления температуры тела. Как только мышь проснется, положите на пол клетки гранулированный корм и воду с желатиновым кормом.
После периода послеоперационного наблюдения в течение двух часов верните мышь в помещение для животных. Через три дня после паратиреоидэктомии проанализируйте 10 микролитров хвостовой крови на ионизированный кальций с помощью такого анализатора, как система газовой системы крови, анализатор кальция и pH. Если паратиреоидэктомия прошла успешно, ионизированный кальций в крови будет равен или меньше минус двух стандартных отклонений от такового у фиктивных контрольных мышей.
Начните с приготовления раствора дифтерийного токсина путем разведения порошка дифтерийного токсина со стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,5 мкг на миллилитр. Стерильно процеживаем раствор и аллокотируем. Введите 5 микрограммов на килограмм массы тела дифтерийному токсину мышам в возрасте от 8 до 10 недель, экспрессируя рецепторы дифтерийного токсина в паращитовидных железах.
Через три дня после второй инъекции дифтерийного токсина сдайте анализ на 10 микролитров хвостовой крови на ионизированный кальций, как и раньше. Ниже приведены репрезентативные изображения различных расположений паращитовидных желез у мышей, экспрессирующих GFP именно в паращитовидной железе. У мышей было две или три зеленые паращитовидные железы.
Большинство паращитовидных желез располагались вблизи верхней границы или рядом с нижней границей щитовидной железы. В редких случаях некоторые паращитовидные железы располагались эктопически. Одним из преимуществ нашей модели мыши является то, что щитовидная железа остается неповрежденной.
На этом рисунке показан уровень ТТГ у мышей GFP-PTX через три месяца после паратиреоидэктомии. На этом рисунке показаны измерения T4. У мышей GFP-PTX концентрации ТТГ и Т4 не отличались от контрольных мышей.
На этом изображении показан уровень кальция в крови и уровень ПТГ у мышей GFP-PTX. На этом изображении показан уровень кальция в крови и уровень ПТГ у мышей, которым вводили дифтерийный токсин PTHcre-iDTR. Как у мышей GFP-PTX, так и у мышей, которым вводили ДТ, наблюдалась стабильная гипокальциемия и снижение уровня ПТГ в течение трехмесячного периода наблюдения.
После освоения паратиреоидэктомия под контролем GFP может быть выполнена примерно за 20 минут в течение всей процедуры. Однократная инъекция дифтерийного токсина занимает не более минуты, если она выполнена правильно. После этой процедуры у этих мышей развивается гипопаратиреоз, и их можно использовать в качестве доклинической модели заболевания.
Могут быть рассмотрены такие вопросы, как эффективность различных аналогов гормона ПТГ в лечении гипопаратиреоза. Не забывайте, что дифтерийный токсин опасен, и что работники должны иметь обычные прививки от дифтерийного токсина. Во время выполнения этих процедур всегда следует надевать средства индивидуальной защиты, такие как маски и перчатки.
Обзор
В данном исследовании представлены две методики создания мышиных моделей приобретенного гипопаратиреоза, которые необходимы для изучения новых лекарственных препаратов. Данные модели позволяют точно удалять паращитовидные железы при сохранении функции щитовидной железы, что облегчает исследование этого состояния.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Эндокринология
- Животные модели
Теоретические основы
- Приобретенный гипопаратиреоз представляет собой состояние, которое может быть трудно изучать на людях.
- Мышиные модели обеспечивают контролируемую среду для проведения исследований.
- Существующие методы могут неэффективно сохранять функцию щитовидной железы при удалении околощитовидных желез.
- Понимание механизмов гипопаратиреоза может привести к созданию более эффективных вариантов лечения.
Цель исследования
- Для создания моделей мышей, имитирующих приобретенный гипопаратиреоз.
- Для изучения влияния терапии аналогами ПТГ на уровни кальция в сыворотке крови.
- Для исследования влияния гипопаратиреоза на прочность костей.
Используемые методы
- Хирургическая паратиреоидэктомия с применением флуоресцентной навигации для идентификации околощитовидных желез.
- Инъекция дифтерийного токсина для селективного воздействия на клетки околощитовидных желез.
- Мониторинг уровней кальция в сыворотке крови и ПТГ после операции.
- Использование методов визуализации для определения локализации околощитовидных желез.
Основные результаты
- Успешное создание стабильных моделей мышей с гипопаратиреозом.
- Сохранение функции щитовидной железы при удалении околощитовидных желез.
- Демонстрируемая гипокальциемия и снижение уровней ПТГ в моделях.
- Возможность использования моделей для оценки эффективности аналогов гормона ПТГ.
Выводы
- Разработанные модели мышей представляют ценность для изучения гипопаратиреоза.
- Они позволяют проводить исследования потенциальных методов лечения без влияния на функцию щитовидной железы.
- В будущих исследованиях эти модели могут быть использованы для поиска ответов на важные клинические вопросы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Надежные доклинические модели приобретенного гипопаратиреоза необходимы для оценки терапии аналогами ПТГ и понимания гомеостаза кальция без влияния сопутствующей дисфункции щитовидной железы. Эти двойные модели позволяют проводить валидацию мишеней и снижение механистических рисков, обеспечивая стабильные, воспроизводимые фенотипы с сохраненной функцией щитовидной железы, что способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок на ранних этапах поиска. Возможность моделирования патофизиологии заболеваний человека на мышах повышает трансляционную преемственность и значимость портфеля эндокринных терапевтических средств.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать ПТГ-зависимые пути и проверять терапевтические гипотезы в генетически доступной системе.
- Операционная ценность: обеспечивает стабильный гипокальциемический фенотип для получения согласованных фармакологических показателей в различных когортах исследования.
- Прогностическая ценность: позволяет оценить взаимодействие с мишенью и точность нижележащего сигналинга для модуляторов рецептора ПТГ.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем с количественно определяемыми показателями сывороточного кальция и ПТГ для стандартизации анализа.
- Операционная ценность: Обеспечение воспроизводимой абляции под контролем флуоресценции или индуцированной токсином, подходящей для высокопроизводительного скрининга соединений.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных терапевтических методов, направленных на регуляцию кальция.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Модели отражают патофизиологию гипопаратиреоза у человека, что позволяет проводить тестирование систем, имеющее значение для данного заболевания.
- Практическая ценность: Облегчает лонгитюдный мониторинг показателей обмена костной ткани и регуляции уровня кальция.
- Прогностическая достоверность: Позволяет принимать решения о продвижении этапов с учетом рисков на основе устойчивой фенотипической стабильности в течение трех месяцев.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данные модели интегрированы в непрерывный цикл разработки лекарств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, предоставляя релевантную системе заболевания модель для оценки эндокринных препаратов.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверить гипотезу об эффективности аналогов ПТГ в отношении уровня кальция в сыворотке крови без влияния факторов щитовидной железы.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стабильных, количественно определяемых гипокальциемических фенотипов, подходящих для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: Обеспечивает получение показателей уровней ионизированного кальция и ПТГ, что помогает командам сравнивать эффекты лечения и модуляцию мишени.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет поддержания стабильного фенотипа и возможности оценки прочности костей.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемый метод для различных проектов по исследованию агонистов кальций-чувствительных рецепторов, аналогов ПТГ или костных анаболиков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишеней за счет механистического снижения рисков при воздействии на путь PTH.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость с помощью флуоресцентно-навигируемой хирургии или индуцибельной абляции токсином.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях в программах по изучению гомеостаза кальция.
- Влияние на портфель: Приоритизация с поправкой на риск, основанная на транслируемой фенотипической точности и дизайне, предусматривающем сохранение щитовидной железы.
Особенности реализации
- Требуемый опыт включает проведение операций на мышах, флуоресцентную микроскопию и работу с токсинами.
- Необходимое оборудование включает диссекционные микроскопы с возможностью флуоресценции и анализаторы кальция.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразных протоколов анестезии, послеоперационного мониторинга и измерения ионизированного кальция.
- При адаптации метода следует учитывать вариабельность эктопических желез и видоспецифическое дозирование токсина.
- Практические ограничения включают требования по биобезопасности при работе с дифтерийным токсином и зависимость результата от хирургических навыков при абляции под контролем GFP.
