Два методы, чтобы создать Hypoparathyroid Мыши: паратиреоидэктомию Использование GFP железах и дифтерийно-Токсин-опосредованной паратиреоидного абляции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать две мышиные модели приобретенного гипопаратиреоза, которые просты в использовании, дают стабильный фенотип и оставляют функцию щитовидной железы нетронутой. Основное преимущество этих двух моделей заключается в том, что они позволяют точно удалять паращитовидные железы у мышей либо с помощью флуоресцентной хирургии, либо с помощью специфической экспрессии рецептора дифтерийного токсина при ПТГ, что позволяет избирательно нацеливаться на клетки и уничтожать их, не вмешиваясь в соседнюю щитовидную железу. Мы надеемся, что наши мышиные модели смогут ответить на ключевые вопросы в области гипопаратиреоза.

Например, может ли аналог ПТГ помочь поддерживать нормальный уровень кальция в сыворотке крови без увеличения экскреции кальция с мочой? Эти модели также могут быть использованы для изучения других клинических вопросов при гипопаратиреозе. Например, влияет ли гипопаратиреоз на прочность костей и меняется ли она при лечении?

Пациентам трудно ответить на подобные вопросы, но эти модели мышей могут быть использованы для их решения. Начните с обезболивания мышей в возрасте от 8 до 10 недель, экспрессируя GFP конкретно в паращитовидных железах в соответствии с утвержденным протоколом. Уложите животное в положение лежа на спине и обеспечьте соответствующую глубину анестезии за счет отсутствия защемления пальца ноги, рефлекса отмены или других средств.

Продезинфицируйте выбритую кожу с помощью антисептической салфетки с повидон-йодом, а затем подготовьте место разреза с помощью хирургического скраба и ополаскивания спиртом в соответствии с утвержденным протоколом. Далее накройте животное стерильными хирургическими простынями, чтобы уменьшить загрязнение места операции.

После разрезания 2-сантиметрового продольного разреза хирургическим скальпелем используйте изогнутые зубчатые щипцы для рассечения фасции, а слюнные железы отодвигайте в сторону. Затем, рассматривая операционное поле через диссекционный микроскоп, с помощью острых щипцов разрежьте и отделите паратрахеальные мышцы и обнажите трахею. Определите правую и левую доли щитовидной железы, расположенные рядом с трахеей.

Затем переключите источник света на флуоресцентный свет и визуализируйте две зеленые флуоресцентные паращитовидные железы. У грызунов обычно есть только две паращитовидные железы. Если вы не можете идентифицировать две паращитовидные железы рядом со щитовидной железой с каждой стороны, следует заподозрить эктопически расположенные паращитовидные железы и провести тщательный поиск их вдоль трахеи.

Далее с помощью хирургических щипцов и ножниц аккуратно удалите зеленые паращитовидные железы и тщательно проверьте вдоль трахеи, чтобы убедиться, что вся зеленая ткань была удалена. Используйте стерильную марлю для гемостаза. Закройте паратрахеальные мышцы прерывистыми швами.

Закройте разрез кожи швами Холстеда. Поместите послеоперационное животное в отдельную клетку на согревающую подушку для восстановления температуры тела. Как только мышь проснется, положите на пол клетки гранулированный корм и воду с желатиновым кормом.

После периода послеоперационного наблюдения в течение двух часов верните мышь в помещение для животных. Через три дня после паратиреоидэктомии проанализируйте 10 микролитров хвостовой крови на ионизированный кальций с помощью такого анализатора, как система газовой системы крови, анализатор кальция и pH. Если паратиреоидэктомия прошла успешно, ионизированный кальций в крови будет равен или меньше минус двух стандартных отклонений от такового у фиктивных контрольных мышей.

Начните с приготовления раствора дифтерийного токсина путем разведения порошка дифтерийного токсина со стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,5 мкг на миллилитр. Стерильно процеживаем раствор и аллокотируем. Введите 5 микрограммов на килограмм массы тела дифтерийному токсину мышам в возрасте от 8 до 10 недель, экспрессируя рецепторы дифтерийного токсина в паращитовидных железах.

Через три дня после второй инъекции дифтерийного токсина сдайте анализ на 10 микролитров хвостовой крови на ионизированный кальций, как и раньше. Ниже приведены репрезентативные изображения различных расположений паращитовидных желез у мышей, экспрессирующих GFP именно в паращитовидной железе. У мышей было две или три зеленые паращитовидные железы.

Большинство паращитовидных желез располагались вблизи верхней границы или рядом с нижней границей щитовидной железы. В редких случаях некоторые паращитовидные железы располагались эктопически. Одним из преимуществ нашей модели мыши является то, что щитовидная железа остается неповрежденной.

На этом рисунке показан уровень ТТГ у мышей GFP-PTX через три месяца после паратиреоидэктомии. На этом рисунке показаны измерения T4. У мышей GFP-PTX концентрации ТТГ и Т4 не отличались от контрольных мышей.

На этом изображении показан уровень кальция в крови и уровень ПТГ у мышей GFP-PTX. На этом изображении показан уровень кальция в крови и уровень ПТГ у мышей, которым вводили дифтерийный токсин PTHcre-iDTR. Как у мышей GFP-PTX, так и у мышей, которым вводили ДТ, наблюдалась стабильная гипокальциемия и снижение уровня ПТГ в течение трехмесячного периода наблюдения.

После освоения паратиреоидэктомия под контролем GFP может быть выполнена примерно за 20 минут в течение всей процедуры. Однократная инъекция дифтерийного токсина занимает не более минуты, если она выполнена правильно. После этой процедуры у этих мышей развивается гипопаратиреоз, и их можно использовать в качестве доклинической модели заболевания.

Могут быть рассмотрены такие вопросы, как эффективность различных аналогов гормона ПТГ в лечении гипопаратиреоза. Не забывайте, что дифтерийный токсин опасен, и что работники должны иметь обычные прививки от дифтерийного токсина. Во время выполнения этих процедур всегда следует надевать средства индивидуальной защиты, такие как маски и перчатки.