Производство, Кристаллизация и структура Определение C. несговорчивый PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном выращивании кристаллов дифракционного качества с одной решеткой рекомбинантного белка пролина пролин-эндопептидазы-1, или rPPEP-1. Без этого метода rPPEP-1 мгновенно дает сильно разросшиеся кристаллы, не пригодные для рентгеноструктурного анализа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что большое количество хорошо упорядоченных и хорошо дифракционных кристаллов для структурного определения rPPEP-1 может быть получено за короткий промежуток времени и с ограниченным материаловложением.

В этой методике используется метод микрогородов, и она может быть адаптирована для каждого успешного начального условия кристаллизации rPPEP-1, а также его субстратных пептидных комплексов. Этот метод может быть адаптирован для получения хорошо упорядоченных кристаллов практически каждого белка, из которого получаются сросшиеся кристаллы. Его также можно использовать в экспериментах по перекрестному посеву, вариации белка или в экспериментах по сокристаллизации с малыми молекулами.

Визуальная демонстрация работы с методами кристаллизации имеет решающее значение, поскольку даже небольшие вариации могут оказать существенное влияние на дифракционное качество кристаллов. Проводите испытания кристаллизации в сидячем каплевидном формате с использованием стандартных имеющихся в продаже сит и кристаллизационного робота. Сначала сконцентрируйте очищенный белок до 12 мг на миллилитр с помощью центробежного ультрафильтрационного устройства с пятиминутными интервалами при 4000 г и четырех градусах Цельсия.

Перемешивайте белок после каждого интервала, чтобы предотвратить выпадение осадков и ухудшение. Определите концентрацию белка на расстоянии 280 нанометров, используя коэффициент экстинкции 25 900 на молярный сантиметр. После уравновешивания белка до 20 градусов Цельсия очистите все частицы и пыль центрифугированием в течение 10 минут при 16000 умноженных на g и 20 градусов Цельсия.

Для выполнения кристаллических сит используются предварительно заполненные кристаллизационные пластины, запечатанные и хранящиеся при температуре четыре градуса Цельсия. При постановке испытаний работайте быстро, так как небольшие объемы быстро высыхают. Также по возможности используйте камеру влажности вокруг док-станции робота.

После уравновешивания всех кристаллизационных планшетов до 20 градусов Цельсия установите экран путем пипетирования резервуара с белком в подскважины от двух до четырех. Используйте каплю объемом 300 нанолитров. Используйте соотношение белка к коллектору 200:100 для второй скважины, 150:150 для третьей скважины и 100:200 для четвертой скважины.

Сразу же запечатайте тарелку и поместите ее в камеру при температуре 20 градусов Цельсия. Осматривайте лотки после установки каждый день в течение первой недели, а затем проводите еженедельный осмотр. Для сокристаллизации комплексов субстрата пептида rPPEP-1 смешать rPPEP-1 в дозе 24 мг/миллилитр в соотношении 1:1 с семикратным молярным избытком пептидного раствора уложить лиофилизированный порошок, растворенный в трис-буферном физрастворе.

После инкубации в течение 30 минут при температуре 20 градусов Цельсия очистите все частицы и пыль центрифугированием в течение 10 минут при 16000 умноженных на g и 20 градусах Цельсия. Приступайте к кристаллизации, используя ту же процедуру микропосева, что и для несвязанного белка rPPEP-1. Сильно сросшиеся кристаллы rPPEP-1 появились через двое суток в состоянии, содержащем 2,4 моляра аммонийфосфата двухосновного и 0,1 моляра трисапсила pH 8,5.

Чтобы оптимизировать начальное состояние, используйте программное обеспечение для расчета объемов и схему пипетирования, чтобы получить два миллилитра каждого условия, что позволяет провести 10 экранов оптимизации. Условия включают от 1,8 до 2,55 молярного двухосновного фосфата аммония с шагом 0,15 моляра, а также 0,1 моляра трисапзеала pH от 7,5 до 9,0 с шагом 0,5 единиц pH. Подготовьте сетчатый экран, состоящий из 24 условий, из исходных растворов.

Используйте схему пипетирования для составления индивидуальных условий. Внесите 200 микролитров каждого раствора сетки в лунки 24-луночного планшета и уравновесьте планшет при температуре 20 градусов Цельсия. Вручную установите кристаллизационную пластину.

Используйте объем капель в три микролитра и соотношение белка к резервуару 2:1, 1,5:1:5 и 1:2. В этом случае используйте пипетку прямого вытеснения, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Сразу же запечатайте пластину.

Затем поместите тарелку в камеру при температуре 20 градусов Цельсия. Через один-четыре дня в четырех состояниях появляются сильно сросшиеся кристаллы rPPEP-1, содержащие 2,55 моляра аммонийфосфата двухосновного и 0,1 моляра трисапсил pH от 7,5 до 9,0, в то время как в остальных 20 условиях кристаллы не образуются. Проводят процедуру микропосева для получения монокристаллов рППЭП-1 в этих условиях.

Чтобы приготовить микросеменной подвой, сначала выберите одиночный сросшийся кристалл из одного из удачных условий. Затем перелейте 50 микролитров соответствующего маточного раствора в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую небольшую, хорошо отполированную стеклянную бусину и один микролитр маточного раствора, на предметное стекло. С помощью установленной нейлоновой смазки выловите кристалл и перенесите его в каплю на предметном стекле стеклянной крышки.

Затем перенесите жидкость, содержащую кристалл, в трубку и делайте вихрь с высокой скоростью в течение 30 секунд, убедившись, что стеклянная бусина вращается. Сделайте разведение семенного материала в соотношении 1:1000 в новую 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую ту же свежеприготовленную кондицию, и тщательно перемешайте в течение пяти секунд. Далее снимите уплотнитель пластины, закрывающей 20 условий с прозрачными каплями.

0,5 микролитра семенного подвойа в лунки. Закройте пластину и поместите ее в камеру при температуре 20 градусов Цельсия. После применения этого метода микропосева через несколько часов или нескольких дней после установки в различных условиях появляются монокристаллы с высоким дифракционным качеством, содержащие от 1,8 до 2,4 молярного фосфата аммония и 0,1 моляра триса pH от 7,5 до 9.

Кристаллы вырастают до размера от 100 до 200 микрон в наибольшем размере. Выберите оптимальный размер нейлоновой петли для максимальной длины выбранных кристаллов, поместив петлю на уплотнительную ленту чуть выше кристалла и фокусируясь вверх и вниз. Типичный самый длинный доступ кристаллов rPPEP-1 составляет от 100 до 200 микрон.

Также подготовьте соответствующую криокондицию. Наполните пенопласты жидким азотом. Затем загрузите в флакон хомут и предварительно охладите его в жидком азоте, наполненном 800 миллилитрами пенопласта.

Поместите криокановый держатель с маркировкой подходящего идентификатора и криогиль в заполненный жидким азотом двухлитровый пенопласт. Затем нагрузите магнитную палочку с помощью установленной нейлоновой петли нужного размера. Далее разрежьте острым скальпелем герметизирующую ленту на кристаллизационной пластине и снимите ее щипцами.

Нанесите пипеткой один микролитр криокондиции на предметное стекло крышки. На этом этапе особенно важно работать быстро, так как высыхание кристалла или крошечного объема криорастворения в контуре может привести к колебаниям качества кристалла или даже к полной потере дифракции. Все этапы работы с кристаллами должны выполняться под стереомикроскопом.

Если кристалл прилипает к пластиковой поверхности, отделите его от земли, деформировав окружающий пластик с помощью акупунктурной иглы. Извлеките кристалл из капли, выудлив его с помощью установленной нейлоновой петли. Быстро переведите кристалл в каплю криокондиции и дайте ему уравновеситься в течение одной секунды.

Затем как можно быстрее выудите кристалл из капли с помощью установленной нейлоновой петли. Немедленно погрузите извлеченный кристалл в жидкий азот. Когда жидкий азот вокруг смонтированной петли перестанет кипеть, поместите петлю в флакон.

Поместите флакон на держатель для криоканов. Как только держатель будет загружен шестью флаконами, поместите криорукав вокруг держателя. Храните кристаллы в резервуаре, наполненном жидким азотом, до использования.

Чтобы выполнить сбор данных, осторожно извлеките установленный кристалл из криокана с помощью зажима и храните его в пенопласте для транспортировки. Переместите ограничитель луча и детектор в парковочное положение и переместите криосопло вверх на несколько миллиметров. Установите основание криоколпачка на головку гониометра, удерживая основание пальцами и быстро снимая флакон.

Затем переместите криосоплу и остановку луча обратно на место и центрируйте кристалл. Всегда будьте осторожны и не прикасайтесь к ограничителю луча или детектору. Перейдите к сбору набора данных на 180 градусов с углом колебания 0,1 градуса, как показано здесь.

Здесь показаны сильно переросшие кристаллы rPPEP-1, полученные в результате первичного скрининга с использованием коммерческих кристаллизационных экранов в 1,4 триосновного дигидрата цитрата натрия, 0,1 моляра натрия HEPES, pH 7,5. Здесь представлены кристаллы, полученные в результате первичного скрининга с таксиматом 60% объема, pH 7,0, 0,1 моляра пропана BIS-TRIS, pH 7,0. Кристаллы также появились в 2,4 моляра аммонийфосфата двухосновного, 0,1 моляра триса, pH 8,5.

После применения процедуры оптимизации микропосева монокристаллы содержались в нескольких состояниях, включая 2,1 молярного аммонийфосфата двухосновного, 0,1 молярного триса pH 8 и 2,25 молярного аммонийфосфата двухосновного, 0,1 молярного триса, pH 8. Кристаллы, установленные в нейлоновых петлях, имеют размер от 100 до 200 микрон и при микроскопическом рассмотрении кажутся имеющими одну решетку. Рентгеновский дифракционный анализ показывает, что эти кристаллы действительно демонстрируют единую решетку и дифрагируют рентгеновские лучи с разрешением, близким к атомному.

Решение кристаллической структуры рекомбинантного комплекса пептидов субстрата PPEP-1 дает представление о способе связывания субстрата PPEP-1. Субстратный пептид может диффундировать в субстратную связывающую группу PPEP-1 при его открытом подтверждении. Затем, когда происходит замыкание петли, субстрат взаимодействует с PPEP-1 посредством водородных связей и уникальной алифатической и ароматической сети боковых цепей, расположенной на S-петле.

Субстрат связывается в уникальной двойной изломленной конформации с изломами на пептидной связи шипения и связи прайм-пептида P2 к прайм-пептидной связи P3. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить монорешетчатые хорошо дифракционные кристаллы рекомбинантного PPEP-1 для структурных исследований. Аналогичные подходы могут быть использованы с другими белками, что дает сильно переплетенные кристаллы и дальнейшее изменение температуры инкубации и разведения С-материала.

Благодаря своей универсальности и простоте использования, этот простой метод следует пробовать в каждом процессе оптимизации кристаллов.