Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать внеклеточный матрикс из культивируемых клеток для широкого спектра последующих экспериментов, чтобы помочь понять функции и свойства внеклеточного матрикса в нормальных тканях и патологических процессах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области внеклеточного матрикса, такие как организация, молекулярный состав, белковые взаимодействия или функциональные свойства внеклеточного матрикса. Кроме того, внеклеточный матрикс может быть получен из любого типа адгезивных клеток.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что их можно проводить в разных масштабах для эффективного удаления клеток и сохранения белков внеклеточного матрикса. Демонстрировать процедуру будут Сильвия Розини, аспирант моей лаборатории, и Эндрю Хеллуэлл, научный сотрудник с докторской степенью. Для начала пластинчатые клетки на покровных слипах для визуализации живых клеток и внеклеточного матрикса или ВКМ.

Для исследований флуоресцентной микроскопии используется фиксированная ВКМ. Или для подготовки клеточной ЭКМ для мелкомасштабных функциональных исследований. Инкубируйте клетки при соответствующей температуре и влажности в течение времени, подходящего для того, чтобы клетки откладывали ECM.

Обычно более 16 часов. В вытяжном шкафу приготовьте 20 миллимолярный гидроксид аммония в подходящем сосуде, используя деионизированную воду для разбавления исходного раствора один к 14. Извлеките клетки из инкубатора и аккуратно удалите питательную среду.

Затем добавьте PBS без кальция или магния, аккуратно высыпая у стенки блюда. Дважды покачайте посуду и слейте жидкость. Затем повторите стирку еще два раза.

В вытяжке снимите последнюю промывку PBS, добавьте 1,5 миллилитра гидроксида аммония на 60-миллиметровую посуду и выдержите тарелки при комнатной температуре в течение пяти минут. Аккуратно помешивайте посуду каждую минуту, чтобы обеспечить лизис всех клеток. Затем добавьте обильное количество деионизированной воды в каждую тарелку и раскачайте тарелку.

Затем слейте растворимый материал гидроксида аммония, который состоит из гидроксида аммония, лизированных клеток и деионизированной воды. Промойте нерастворимый слой ECM в обильном количестве деионизированной воды еще четыре раза, чтобы обеспечить полное удаление всего растворенного в гидроксиде аммония материала. Важно, чтобы клетки были полностью удалены с обильными промывками в деионизированной воде.

Если эти шаги не выполнены должным образом, клеточный материал может остаться на чашке и загрязнить последующий анализ. Для исследования ВКМ методом иммунофлюоресценции удалите остатки деионизированной воды, зафиксируйте ВКМ добавлением 2% параформальдегида, сокращенно ПФА, и выдержите посуду при комнатной температуре в течение 10 минут. Используйте PBS для промывки каждого фиксированного образца дважды и выбросьте раствор в контейнер для жидких отходов перед проведением флуоресцентной микроскопии в соответствии с текстовым протоколом.

В ламинарном проточном колпаке готовят стерильные растворы PBS без кальция и магния, 20 миллимолярного гидроксида аммония и деионизированной воды, пропуская каждый раствор через стерильный фильтр 0,2 мкм в соответствующую стерильную емкость. Сохраняя стерильную технику, используйте стерильный PBS, чтобы аккуратно промыть клетки продуцента матрицы на покровных листках три раза. После снятия последней промывки PBS добавьте в 1,5 миллиметра 1,5 миллилитров стерильного гидроксида аммония и выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут с прерывистым покачиванием.

Добавьте в посуду обильное количество стерильной деионизированной воды с покачиванием, слейте лизат клеток в соответствующую емкость для отходов. Повторите эту промывку еще четыре раза, чтобы обеспечить полное удаление растворенного материала. После трипсинизации и гранулирования клеток в соответствии с текстовым протоколом испытуемые клетки ресуспендируют в свежей стерильной среде, а подсчет клеток осуществляется с помощью гемоцитометра.

Затем поместите соответствующее количество исследуемых клеток и питательной среды в стерильную изолированную ЭБУ на покровных листах и инкубируйте в течение двух-трех часов или в течение необходимого времени. Для изучения организации актинового цитоскелета фиксируют исследуемые клетки в 2%-ном PFA и окрашивают их FITC-фаллоидином для визуализации F-актина, а также DAPI для визуализации ядер. После культивирования большого количества ячеек, а затем удаления ячеек и промывки ECM, как показано ранее в видео, наклоните каждую пластину под углом, чтобы слить остатки воды на дно чашки, и с помощью пипетки P200 осторожно удалите остатки воды до тех пор, пока пластина полностью не высохнет.

В то же время нагрейте буфер для образцов SDS-PAGE, содержащий 100 миллимолярных ДДТ, до 95 градусов Цельсия в течение двух минут и добавьте по 200 микролитров в каждую 100-миллиметровую пластину, подлежащую исследованию методом иммуноблоттинга. С помощью скребка для клеток соберите образец с одной стороны чашки, а с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров переложите его в пробирку. Чтобы проанализировать ECM с помощью масс-спектрометрии, приготовьте более концентрированный образец, собрав буфер для образцов SDS-PAGE из чашки, повторно нагрев его до 95 градусов Цельсия и используя ту же аликвоту на двух-трех дополнительных планшетах.

Перенесите остаточный экстракт буфера проб SDS-PAGE с наконечника скребка ячеек в пробирку, чтобы свести к минимуму потери материала ECM. Для эффективной экстракции изолированного ЭБУ в буфер для образцов SDS-PAGE необходимо, чтобы буфер для образца был нагрет до 95 градусов, содержал восстановитель и чтобы планшет был подвергнут тщательной очистке. Здесь показаны клетки COS-7, выращенные на стеклянных покровных стеклах.

Обработка гидроксидом аммония эффективно удаляла клетки, что было установлено потерей клеточных ядер и актинового цитоскелета. На этом рисунке клетки COS-7 трансфицировали RFP-меткой тромбоспондином-1. А ЭВМ визуализировался до и после обработки гидроксидом аммония.

Предполагается, что флуоресцентные точки, идентифицированные на обоих изображениях, связаны с ECM. В этом эксперименте дермальные фибробласты человека были удалены с помощью гидроксида аммония, а ВКМ был исследован антителом против коллагена 1, которое продемонстрировало характерный рисунок окрашивания малоберцовой кости и сетчатой структуры. Как показано на рисунке, окрашивание фибронектина проводилось на ВКМ из выделенных гидроксидом аммония клеток хондросаркомы крыс

В этом примере тестовые клетки COS-7 в течение двух часов помещали на стерильную ВКМ, продуцируемую клетками RCS, и анализировали на организацию F-актина путем окрашивания FITC-фаллоидином. По сравнению с ячейками COS-7, производящими собственную ВКМ. В этом эксперименте ВКМ выделяли из клеток хондросаркомы крыс, а белки, полученные из ВКМ, затем разделяли с помощью SDS-PAGE.

И четыре основные полосы были выделены и проанализированы с помощью масс-спектрометрии. Были идентифицированы фибронектин, тромбоспондин-1 и 5, а также матрилин-1. Наконец, эндогенную ВКМ дермальных фибробластов человека анализировали методом иммуноблоттинга.

Были обнаружены фибронектин и тромбоспондин-1, в то время как внутриклеточные белки альфа-тубулин и бета-актин отсутствовали. После освоения удаление ячеек гидроксидом аммония и экстракция ECM с горячим буфером для проб SDS-PAGE из трех 100-миллиметровых чашек может быть выполнена за один час, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что каждый раз нужно готовить свежие рабочие растворы гидроксида аммония для удаления клеток.

Также очень важно использовать обильные промывки деионизированной водой, чтобы убедиться, что все клетки удалены. После этой процедуры могут быть выполнены такие методы, как протеомный анализ экстрагированной ВКМ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как относительное обилие белков ВКМ, продуцируемых различными типами клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно удалять клетки из тарелок для клеточных культур и как извлекать ECM.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжке и ношение средств индивидуальной защиты.