В гибридизация для точной локализации стенограммы в растениях

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации паттернов экспрессии мРНК на клеточном уровне с высокой чувствительностью и специфичностью. Для этого сначала формалино-фиксированные, залитые парафином срезы тканей обрабатывают серией растворов для удаления воска, пермеабилизации тканей и блокирования положительно заряженных минорных групп в тканях, которые могут создавать фоновый сигнал. Впоследствии в срезы тканей вводят меченные DIG РНК-зонды, специфичные для интересующего гена, после чего предметные стекла инкубируют в течение ночи для гибридизации.

Затем предметные стекла обрабатывают РНКазами А для удаления неспецифически связанного зонда из срезов, после чего их инкубируют с антителами к DIG. Это позволяет визуализировать гибридизованный зонд с помощью колориметрической химической реакции.

Результаты демонстрируют темно-синий сигнал, обнаруживаемый при световой микроскопии именно в тех клетках ткани, в которых экспрессируется изучаемый ген. Основное преимущество данного метода по сравнению с другими способами анализа экспрессии, такими как R-T-P-C-R, микрочипирование или секвенирование следующего поколения (Next Generation Sequencing), заключается в том, что представленный здесь протокол гибридизации in situ позволяет выявить паттерн экспрессии интересующего гена непосредственно в контексте ткани. Эти методы включают множество этапов, которые лучше всего освоить с помощью наглядных демонстраций.

Мы продемонстрируем, как выполнять срезы и заливку тканей, а также разберем ключевые этапы протокола гибридизации Al, которые сложно освоить самостоятельно. Метод заливки тканей, фиксированных паральдегидом, будет варьироваться в зависимости от типа анализируемой ткани. Самым важным моментом здесь является обеспечение правильной ориентации образцов для последующего изготовления срезов.

Одним из методов заливки является использование пластиковых форм и колец. Для начала данной процедуры прогрейте формы на нагревательной плите при температуре 60 °C, после чего залейте в формы расплавленный парафин. Затем с помощью подогретого пинцета перенесите образец ткани в каждую форму и ориентируйте его в нужном положении.

Осторожно перенесите форму с планшета на лабораторный стол и наденьте белое кольцо на форму. Добавьте дополнительный воск. Перед серированием дайте воску постепенно остыть и затвердеть.

Доведите блоки до комнатной температуры, затем обрежьте каждый блок, придав ему форму трапеции, оставив около одного миллиметра воска вокруг образца. Поместите обрезанный блок в микротом так, чтобы более длинная из двух параллельных граней находилась снизу. Осторожно подведите блок к лезвию и убедитесь, что поверхность блока параллельна плоскости среза лезвия.

Толщиной от 8 до 10 микрон. Разложите восковые ленты на нелипкой поверхности, например, на алюминиевой фольге, и выберите интересующие участки под диссекционным микроскопом. Затем отметьте стекла ProbBon Plus карандашом.

Не используйте ручки для нанесения меток, так как они будут стерты в ходе протокола гибридизации INI two. Распределите по 1 мл чистой воды milli Q на каждое стекло. Осторожно поместите интересующие срезы на поверхность воды при комнатной температуре.

Убедитесь, что глянцевая сторона обращена к воде. Медленно перенесите предметное стекло на подогреватель предметных стекол. Установите температуру от 35 до 37 °C.

Использование данного температурного диапазона вместо общепринятых 42 °C предотвращает образование пузырьков воздуха под срезами. Через пять минут аккуратно, но одним плавным движением слейте воду, чтобы лента срезов опустилась на предметное стекло. Оставьте стекла подсыхать как минимум на несколько часов или на ночь при 37 °C для обеспечения прикрепления ткани к стеклу перед подготовкой срезов ткани.

Для проведения гибридизации in situ срезы сначала подвергают депарафинизации и последующей регидратации. Инкубируйте предметные стекла дважды в растворе Histic Clear по 10 минут. Для регидратации тканей пропустите предметные стекла через серию растворов этанола с убывающей концентрацией, выдерживая в каждом по 30 секунд.

Во время обработки протеазой, которая не показана в данном видео, подготовьте стеклянную чашу с 0,1 молярным раствором триэтиламина и установите ее на магнитную мешалку в вытяжном шкафу. Непосредственно перед помещением металлического штатива для предметных стекол в раствор добавьте 1,25 миллилитра уксусного ангидрида в раствор триэтиламина, буфер и перемешайте. Кроме того, установите систему зажимов и штатив для удержания кассеты с предметными стеклами.

Снизьте скорость перемешивания. Закрепите кассету со слайдами зажимом на штативе и опустите её в раствор, удерживая над магнитным якорем. Продолжайте медленно перемешивать в течение 10 минут, после чего промойте срезы в PBS и снова обезводьте с помощью серии растворов этанола. Срезы тканей готовы к гибридизации.

Поместите предметные стекла на чистую поверхность и дайте им полностью высохнуть на воздухе в течение 5–10 минут. Приготовьте смесь буфера для гибридизации зонда, добавив денатурированный зонд к 80 µL буфера для гибридизации. Для каждого стекла тщательно перемешайте смесь путем пипетирования, стараясь не создавать пузырьков.

Пипеткой нанесите буфер для гибридизации зонда. Распределите его по правому краю предметного стекла. Плавно опустите покровное стекло на предметное стекло, убедившись, что раствор для гибридизации полностью покрывает все срезы и не содержит пузырьков воздуха.

Слегка постучите пальцем по покровному стеклу в местах образования пузырьков воздуха, чтобы вытеснить их из всех срезов ткани. Не снимайте покровное стекло, так как это повредит срезы. Поместите предметные стекла в увлажняющую камеру с бумагой Watman, смоченной в воде UE и в значительной степени покрытой парафином.

Плотно закройте контейнер и инкубируйте стекла при необходимой температуре гибридизации, обычно от 50 до 55 °C в течение 16–20 часов. По завершении протокола гибридизации осторожно снимите покровные стекла со слайдов. Покровное стекло может просто соскользнуть, когда слайд поставят вертикально, но если этого не произошло, не пытайтесь оттянуть его, так как это может повредить срезы.

Вместо этого погрузите предметное стекло в теплый 0,2-кратный раствор SSC на одну или две минуты, чтобы смыть покровное стекло. После снятия покровных стекол поместите предметные стекла в штатив и несколько раз промойте их в 0,2-кратном растворе SSC при температуре 55 °C. После обработки РНКаз перенесите предметные стекла из штатива на дно плоского пластикового контейнера и залейте минимальным объемом блокирующего раствора. Блокируйте стекла в течение 45 минут при комнатной температуре на платформе с медленным перемешиванием.

Затем нанесите минимальный объем раствора антител непосредственно на каждый предметное стекло. Инкубируйте стекла в темноте в течение двух-трех часов при комнатной температуре. По завершении инкубации перенесите стекла в чистый плоский контейнер и промойте их четыре раза минимальным объемом промывочного буфера на встряхивателе при комнатной температуре.

Промойте предметные стекла один раз в TBS и дважды в буфере TN, затем нанесите на стекла свежеприготовленный окрашивающий раствор. Сначала налейте окрашивающий раствор в небольшой пластиковый весовой стаканчик. Затем соедините два стекла так, чтобы срезы были обращены друг к другу.

Погрузите «сэндвич» в раствор, позволяя капиллярному эффекту впитать жидкость. Удалите излишки раствора с предметных стекол с помощью салфетки Kimwipe. Заполните пространство между стеклами красящим раствором.

Повторно отмечаем, что при втекании раствора по предметным стеклам можно аккуратно постучать, чтобы избежать образования пузырьков; затем поместите стекла в пластиковый контейнер и храните при комнатной температуре в темном месте. Здесь представлены репрезентативные результаты, полученные с использованием различных зондов и тканей arabidopsis. Фиолетовый сигнал обеспечивает прямую визуализацию паттерна экспрессии интересующего гена с клеточным разрешением.

На панели A показана локализация транскриптов Meli one в вегетативной верхушке побега. Обратите внимание на наличие пурпурно-синего сигнала в неопределенной зоне меристемы и отсутствие сигнала в окружающих листьях. Панели B–D представляют собой срезы эмбрионов Arabidopsis на торпедообразной стадии, где на панели B показана экспрессия covata three в нескольких эмбриональных стволовых клетках.

На рисунке C показана экспрессия T ML one в эпидермальном слое, а на рисунке D — отсутствие сигнала в срезах, исследованных с помощью случайной отрицательного контрольной РНК. На следующих изображениях представлены результаты, полученные с использованием различных зондов на тканях кукурузы. На панели E показана локализация STM Humalog knotted one в развивающемся зародыше кукурузы.

Обратите внимание, что сильный сигнал в продольных срезах зародышевого стебля и корня меристемы через верхушку вегетативного побега показывает, что ARF3A экспрессируется на осевой нижней поверхности листа на панели F, а гомолог ATML1 OCL4 экспрессируется специфически в эпидермисе на панели G. Как и ожидалось, сигнал гибридизации для отрицательного контрольного зонда на панели H не наблюдался. Здесь представлены ожидаемые результаты различных контрольных точек в процессе транскрипции зондов in vitro. Зонды для гибридизации in situ проверяются на стандартном agarose-геле после транскрипции in vitro, после обработки ДНК и последующей очистки продуктов реакции транскрипции in vitro. После карбонатного гидролиза, когда зонды длиной более 250 пар оснований, такие как зонд 1, готовы к использованию, карбонатный гидролиз приведет к образованию набора более коротких фрагментов зонда.

На данном рисунке представлены результаты цветовой и метрической квалификации зондов с помощью метода дот-блот-анализа. Разведения контрольного зонда с концентрацией 100 нг/мкл в диапазоне от 10⁻¹ до 10⁻⁵, а также три новых меченных DIG-зонда нанесены на трансферную мембрану, которая была инкубирована с анти-DIG антителами и реагентом для анализа. Анализ позволяет оценить концентрацию зонда 2 как 100 нг/мкл, зонда 3 — 10 нг/мкл и зонда 4 — 1 нг/мкл, что указывает на малую вероятность получения качественного сигнала гибридизации in situ для зонда 4. Наконец, данные продольные срезы верхушки вегетативного побега кукурузы (Mace) обеспечивают сравнение между неспецифическим фоновым сигналом и сигналом от эффективно работающей панели зондов.

На рисунке А показан неспецифический фоновый сигнал, в то время как на панели B виден специфический сигнал двухэтапной гибридизации in situ для зонда OC five в наружном слое клеток. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как выполнять многие сложные этапы протоколов инициации гибридизации, что позволит вам определить точные пространственно-временные паттерны экспрессии интересующих вас генов.