В гибридизация для точной локализации стенограммы в растениях

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации паттернов экспрессии мРНК на клеточном уровне с высокой чувствительностью и специфичностью. Это достигается путем предварительного взятия формальных и фиксированных и засаженных парафином срезов тканей через ряд растворов для удаления воскообразного проникновения в ткани и блокирования положительно заряженных минорных групп в тканях, которые могут давать фоновый сигнал. Впоследствии меченые DIG РНК-зонды, специфичные для интересующего гена, инфильтрируются в участки ткани, и предметные стекла гибридизуются в течение ночи.

Далее предметные стекла обрабатываются РНК. A для удаления неспецифически связанного зонда из срезов и последующей инкубации с антителами против DIG. Это позволяет визуализировать гибридный зонд с помощью цветной метрической химической реакции.

Результаты показывают темно-синий сигнал, обнаруживаемый с помощью световой микроскопии, в частности, в тех клетках ткани, в которых экспрессируется интересующий ген. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими нашими методами анализа экспрессии, такими как R-T-P-C-R, микролучевой подход или секвенирование нового поколения, заключается в том, что показанный здесь протокол I гибридизации выявляет паттерн экспрессии гена, представляющего интерес, в его тканевом контексте. Эти методы включают в себя множество шагов, которые лучше всего освоить с помощью визуальных демонстраций.

Мы покажем, как делать секции и встраивать ткани, а также ключевые этапы протокола Al Hybridization pro, которые сложно освоить самостоятельно. Метод встраивания паральдегидных фиксированных тканей будет варьироваться в зависимости от типа анализируемой ткани. Самым важным моментом здесь является обеспечение правильной ориентации образцов для последующего среза.

Одним из способов встраивания является использование пластиковых форм и колец. Чтобы начать эту процедуру, прогрейте формочки на нагревательной тарелке при температуре 60 градусов Цельсия, а затем залейте в формочки расплавленный парафин. Далее с помощью подогретых щипцов перенесите образец ткани в каждую форму и сориентируйте его в нужное положение.

Осторожно переместите форму с тарелки на скамейку и поместите белое кольцо на форму. Добавьте дополнительно моль и воск. Дайте воску остыть и постепенно затвердеть перед разделением.

Прогрейте блоки до комнатной температуры, затем обрежьте каждый блок в трапециевидную форму, оставив вокруг образца около одного миллиметра воска. Поместите обрезанный блок на микротом так, чтобы более длинная из двух параллельных граней находилась внизу. Осторожно поднесите блок вперед к лезвию и убедитесь, что поверхность блока параллельна сечению лезвия.

Толщиной от восьми до 10 мкм. Выровняйте восковые ленты на антипригарной поверхности, например на алюминиевой фольге, и выделите интересующие участки под областью препарирования. Далее отметьте карандашом пробы бон плюс слайды.

Не используйте ручки для маркеров, потому что они будут стерты во время протокола гибридизации INI two. Нанесите один миллилитр чистой воды milli Q на каждую горку. Осторожно всплывите интересующие участки на поверхности воды при комнатной температуре.

Убедитесь, что блестящая сторона обращена к воде. Медленно переложите слайд на грелку для слайдов. Установите температуру от 35 до 37 градусов по Цельсию.

Такой температурный диапазон, в отличие от обычно используемых 42 градусов Цельсия, предотвращает образование пузырьков под секциями. Через пять минут слейте воду аккуратно, но одним плавным движением так, чтобы лента опустилась вниз на горку. Дайте предметным стеклам высохнуть не менее нескольких часов или в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы ткань прилипла к подготовленным тканевым срезам.

Для гибридизации in situ они сначала подвергаются depa и регидратации для окончательной depa. Инкубируйте предметные стекла в двух сменах прозрачного раствора в течение 10 минут каждая. Чтобы регидратировать участки ткани, пропустите предметные стекла через серию уменьшающихся концентраций этанола в течение 30 секунд каждая.

Во время лечения протеазой, которая не показана в этом видео, приготовьте стеклянную чашку с 0,1 молярным раствором амина триатлона и установите ее на перемешивающую пластину в вытяжном шкафу. Непосредственно перед помещением металлической решетки в раствор добавьте 1,25 миллилитра уксусного ангидрида в амин, буфер и лестничный пролет для триатлона. Кроме того, установите систему зажима и подставку для удержания направляющей стойки.

Уменьшите скорость вращения стойки Starr, закрепите решетку на подставке и опустите решетку в раствор, удерживая ее приподнятой над перемешивающей планкой. Продолжайте медленно помешивать в течение 10 минут после промывки в PBS и повторного обезвоживания с помощью серии этанола. Срезы тканей готовы к гибридизации.

Поместите предметные стекла на чистую поверхность и дайте воздуху полностью высохнуть в течение пяти-10 минут. Приготовьте зондовую гибридизационную буферную смесь, добавив денатурированный зонд в 80 микролитров гибридизационного буфера. Для каждой горки хорошо перемешивайте пипеткой плюс, избегайте образования пузырей.

Пипеткой зонд гибридизационный буфер. Перемешайте на правом краю предметного стекла. Постепенно опускайте крышку на предметное стекло, следя за тем, чтобы решение для гибридизации покрывало все секции без пузырей.

Слегка постучите пальцем по крышке, где образуются пузырьки, чтобы вытеснить их со всех участков ткани. Не снимайте ножницы крышки, так как это может повредить секции. Поместите предметные стекла в влажностную камеру, содержащую ватмановскую бумагу, смоченную в воде UE и в значительной степени покрытую парамом.

Плотно закройте коробку, инкубируйте предметные стекла при желаемой температуре гибридизации, обычно от 50 до 55 градусов Цельсия, в течение 16-20 часов. По завершению протокола гибридизации аккуратно снимите покровные листки со слайдов. Защитное стекло может просто отпасть, когда затвор установлен вертикально, но если это не так, не тяните за него, так как это может повредить секции.

Вместо этого погрузите предметное стекло в теплое 0,2 раза SSC на одну или две минуты, чтобы смыть чехол после снятия чехлов, поместите слайды в решетку и промойте несколько раз в 0,2 раза SSC при 55 градусах Цельсия. После обработки РНК предметные стекла переносят из штатива на дно плоской пластиковой коробки и покрывают минимальным объемом блокирующего раствора. Заблокируйте горки на 45 минут комнатной температуры на медленно трясущейся платформе.

Затем нанесите минимальный объем раствора антитела непосредственно на каждое предметное стекло. Высиживайте предметные стекла в темноте в течение двух-трех часов при комнатной температуре. Когда инкубация будет завершена, переложите предметные стекла в чистую плоскую коробку и промойте предметные стекла четыре раза с минимальным объемом промывочного буфера на встряхивающей платформе при комнатной температуре.

Промойте предметные стекла один раз в TBS и два раза в TN буфере, чтобы нанести на предметные стекла свежеприготовленный раствор для окрашивания. Сначала вылейте раствор для окрашивания в небольшую пластиковую чашку для взвешивания. Затем сгруппируйте две горки так, чтобы секции были обращены друг к другу.

Опустите бутерброд в раствор, позволяя капиллярному действию подтянуть раствор. Слейте воду с горок на салфетку ким. Заполните горки раствором для окрашивания.

Опять же, возможно, потребуется постукивать по предметным стеклам по мере поступления раствора, чтобы избежать образования пузырьков, поместите предметные стекла в пластиковую коробку и храните комнатную температуру в темноте. Здесь представлены репрезентативные результаты, полученные с помощью различных зондов и тканей арабидопсиса. Фиолетовый сигнал обеспечивает прямую визуализацию при клеточном разрешении паттерна экспрессии интересующего гена.

На панели А показана локализация побега Meli one transcripts в вегетативной верхушке побега. Обратите внимание на наличие фиолетового синего сигнала в неопределенной меристеме и отсутствие сигнала в окружающих листьях. Панели B 2D представляют собой срезы эмбрионов торпедной стадии arabidopsis, где B демонстрирует экспрессию covata three в нескольких эмбриональных стволовых клетках.

C показывает экспрессию T ML one в эпидермальном слое, а D показывает отсутствие сигнала в срезах, зондированных случайной отрицательной контрольной РНК. На следующих изображениях показаны результаты, полученные с помощью различных зондов на тканях лабиринта. На панели E показана локализация узловатого узла STM Humalog в развивающемся эмбрионе лабиринта.

Обратите внимание на сильный сигнал, специфический в эмбриональном mes стебле и корне, продольные срезы через вершину вегетативного желоба показывают, что ARF 3 A экспрессируется на осевой нижней поверхности листа в панели F, а A T ML один гомолог OCL 4 экспрессируется специфически в эпидермисе. В ожидаемой панели G.As не наблюдалось сигнала гибридизации для отрицательного контрольного зонда на панели H. Здесь показаны ожидаемые результаты различных контрольных точек во время транскрипции зондов in vitro. Гибридизационные зонды in situ проверяются на стандартном геле ARAZ после транскрипции in vitro после обработки ДНК и последующей очистки реакции транскрипции in vitro После карбонатного гидролиза и когда они будут готовы к использованию для зондов длиной более 250 пар оснований, таких как один зонд, карбонатный гидролиз позволит получить ряд более мелких фрагментов зонда.

На этом рисунке показаны результаты цветовой и метрической квалификации зондов методом точечного блот-анализа в диапазоне от 10 до минус одного до 10 до минус пяти контрольного зонда с концентрацией 100 нанограмм на микролитр, и из трех вновь меченых зондов, меченных DIG, обнаруживаются на передаточной мембране, инкубированной с антителами против DIG, и анализе. Анализ позволяет предположить, что расчетная концентрация составляет 100 нанограмм на микролитр для второго зонда, 10 нанограммов на микролитр для третьего зонда и одного нанограмма на микролитр для четвертого зонда, что указывает на то, что четвертый зонд вряд ли даст хороший сигнал от inea до гибридизации. Наконец, эти продольные срезы через вершину вегетативного желоба от Mace позволяют сравнить неспецифический фоновый сигнал с хорошо работающей панелью зонда.

На панели А показан неспецифический фоновый сигнал, в то время как на панели В показан специфический сигнал гибридизации in situ two для зонда OC five во внешнем слое клетки. После просмотра этого вы должны иметь хорошее представление о том, как выполнять многие сложные шаги в протоколах инициализации, чтобы вы могли точно определить временные паттерны давления ваших любимых подростков.