Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Общая цель этой биохимической процедуры заключается в выделении промежуточных фракций, обогащенных филаментами, из нескольких тканей мыши для изучения посттрансляционных модификаций различных тканеспецифичных промежуточных филаментных белков. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области промежуточных филаментов, например, как функция и регуляция этих важных белков цитоскелета, защищающих от стресса, влияет на старение млекопитающих. Основное преимущество этого метода заключается в том, что включение автоматизированного этапа лизиса тканей позволяет пользователям быстро и эффективно обрабатывать несколько образцов тканей.

Для начала добавьте один миллилитр ледяного буфера Triton X-100 с добавлением ингибиторов протеазы в гомогенизатор из стеклянной трубки и поместите его на лед. Извлеките небольшой кусочек ткани из хранилища жидкого азота и поместите его непосредственно в стеклянный гомогенизатор. Затем, постоянно держа гомогенизатор и образец на льду, используйте примерно 50 ударов политетрафторэтиленовой пастилы для гомогенизации образца при минимальном образовании пузырьков.

Перенесите лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду и центрифугируйте образец при температуре 20 000 раз G в четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Далее соберите фракцию растворимой надосадочной жидкости Triton X в отдельную пробирку. Эта фракция может быть использована для иммунопреципитации и анализа растворимого в моющих средствах пула белков IF.

Затем в тканевую гранулу добавляют один миллилитр высокосолевого буфера, дополненного ингибиторами протеазы. Переложите его в чистый гомогенизатор и сделайте 100 ударов. Перенесите гомогенат обратно в микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на вращающийся шейкер в холодильную камеру на один час.

Центрифугируйте гомогенаты при температуре 20 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу один миллилитр ледяного буфера PBS EDTA и переложите его в чистый гомогенизатор в качестве заключительного этапа очистки. После гомогенизации перенесите образец в новую пробирку и центрифугируйте его при температуре 20 000 раз G в четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы получить богатый белком IF экстракт с высоким содержанием соли, или HSC.

Выбросьте надосадочную жидкость и растворите гранулу в 300 микролитрах предварительно подогретого невосстановительного буфера для образца SDS. Сначала разбейте гранулу с помощью пипетирования и вортексирования. А затем нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Вортекс и пипетка по мере необходимости, чтобы убедиться, что гранула полностью растворилась, что может занять несколько минут. Храните все образцы при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия до анализа. Чтобы провести экстракцию РНК, добавьте буфер для лизиса в пробирку, содержащую лизиновую матрицу D, затем добавьте образец ткани в тканевый лизер и дважды проведите импульс в течение 25 секунд каждый.

Отделите лизат от матрицы центрифугированием при 20 000-кратном G. Для экстракции белка добавьте Triton X-100 или буфер для образца SDS при приготовлении общего лизата. В лизиновую трубку с лизиновой матрицей SS. Затем добавьте образец ткани. Кратковременно взбейте образец для перемешивания.

Чтобы приготовить HSC, с помощью магнита удалите шарик из нержавеющей стали из пробирки и центрифугируйте пробирки при температуре 20 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Отделите надосадочную жидкость и фракции гранул и действуйте, как показано ранее в видео. Приготовьте PBST-буфер, добавив от 10 микролитров T20 до 50 миллилитров PBS pH 7,4.

Затем приготовьте раствор антитела к ПТМ, добавив от одного до 10 мкг антитела к 200 мкг ПБСТ. Аликвотируйте 50 микролитров магнитных шариков в микроцентрифужную пробирку. Поместите его на магнит и аспирируйте раствор для хранения шариков.

Конъюгируйте шарики с антителом иммунопреципитации путем ресуспендирования гранул в растворе антитела и инкубации образца на ротаторе при комнатной температуре в течение 20 минут. Поместите трубки на магнит и аспирируйте раствор антитела. Затем с помощью 200 микролитров PBST промыть конъюгированные шарики антител один раз, и удалить раствор.

Добавьте в бусины от 0,6 до одного миллилитра лизата ткани. Перемешайте с помощью аккуратного пипетирования и инкубируйте раствор на ротаторе в холодном помещении в течение трех часов. Поместите трубки на магнит и удалите лизат, затем используйте 200 микролитров PBST, чтобы промыть бусины пять раз.

После последнего этапа промывки соберите бусины и 100 микролитров PBS и переложите бусины в новую, чистую пробирку. Поместите трубку на магнит, затем аспирируйте PBS. Снимите пробирку с магнита и добавьте 100 микролитров буфера для нередуцируемого образца.

Аквотируйте 50 микролитров из тюбика, и соедините его с 5%2ME для получения редуцирующих проб. Нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. С помощью трубки на магните соберите фракцию IP из бусин и переложите ее в свежую пробирку.

Храните образцы при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия до анализа. Чтобы избежать загрязнения образцов белка для масс-спектрометрического анализа, используйте чистые перчатки для работы со всеми гелями и инкубируйте их в чистых контейнерах, которые были вымыты только с помощью DD H2O. Нанесите от 20 до 50 микролитров образца НИУ ВШЭ на гель для страницы SDS в соответствии со стандартными условиями.

После окрашивания геля в соответствии с текстовым протоколом поместите гель между протекторами из пластикового листа. Затем отсканируйте и отметьте полосы, которые будут иссекаться. Используйте новую чистую бритву для вырезания полос белка ПЧ и поместите ленты в чистые микроцентрифужные пробирки на льду перед отправкой их на масс-спектрометрический анализ.

На этом рисунке показан типичный результат НИУ ВШЭ из девяти тканей мышей, выделенных экспресс-методом. Обратите внимание, что этот метод не очень хорошо работает на поджелудочной железе и селезенке, и дает дополнительные полосы в образце толстой кишки. Этот анализ экспрессии генов показывает, что кератин 8 регулируется во время старения.

Кроме того, вестерн-блоттинг показывает, что кератин 8 сильно регулируется в печени старых мышей. Полученная по автоматизированному протоколу печеночная НИУ ВШЭ демонстрирует сильное обогащение гелем кератинов 8 и 18. Масс-спектрометрический анализ показывает, что K8 и K18 в печени старой мыши имеют множественные сайты фосфорилирования и ацетилирования, которые отсутствуют в печени молодой мыши.

Подобно кератиновым изменениям в печени, анализ мозговой ткани с помощью QPCR показывает пятикратную индукцию мРНК GFAP в мозге 24-месячных мышей по сравнению с трехмесячными мышами. Наконец, анализ белков экстрактов с высоким содержанием солей с помощью окрашивания Кумасси и иммуноблоттинг фракций, обогащенных общим и ацетиллизином, показывает, что белок GFAP регулируется и ацетилируется в старом мозге мышей. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как смесь протео на основе масс-спектрометрии, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы важные посттрансляционные модификации и партнеры по связыванию промежуточных филаментных белков при различных физиологических и патофизиологических условиях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять промежуточные филаментные белки из различных тканей млекопитающих.