Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от Ripicephalus microplus Эпителиальные кишечные клетки

Очистка биотинилированного белка клеточной поверхности из эпителиальных клеток кишечника Rhipicephalus microplus. В рамках данного исследования была использована модифицированная методология на основе градиента Перколла для выделения отдельных эпителиальных клеток из микроткани кишечника Rhipicephalus microplus. Поверхностно связанные белки биотинилировали и очищали с помощью магнитных шариков стрептавидина для использования в последующих приложениях.

Вскрытие эпителия кишечника из полунабухающего Rhipicephalus microplus. Вам понадобятся следующие материалы. Приклейте полоску клейкой ленты ко дну чашки Петри.

Добавьте на ленту каплю суперклея. Положите клеща брюшной стороной вниз на суперклей, дав ему высохнуть. Полностью погрузите клеща в 100 мл PBS.

Используя скальпель 11-го размера, разрежьте от верхней части глаз до нижних гирлянд с обеих сторон клеща. С помощью стерильных щипцов полностью удалить скутум и аллоскутум, чтобы обнажить внутренние органы. Удалите тонкие белые нитевидные органы и другие оболочки.

Удалите кишку с помощью щипцов. Хранить кишки в ледяных HBSS и PIC. Диссоциация эпителиальных клеток.

Вам понадобятся следующие материалы. Вылейте вскрытую кишку на клеточное ситечко 70 микрон внутри пробирки Falcon объемом 50 мл. Поскольку внутри трубки Falcon может образоваться вакуум, поднимите фильтр, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха.

Промойте ткани кишечника 50 мл ледяного HBSS с PIC. Ресуспендируйте кишки в 30 мл ледяного HBSS с PIC. При необходимости используйте стерильный скребок для оказания помощи в ресуспензии кишечника.

Центрифуга при 500 г. Удалите надосадочную жидкость и повторите процесс стирки три раза. Ресуспендируйте клетки кишечника в 10 мл DMEM, 2% FCS, 5 миллимолярной ЭДТА, одной миллимолярной TCEP и PIC.

Аккуратно перемешайте. Инкубируйте в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия при медленном вращении с помощью ролика. Отфильтруйте суспензию через сетчатое фильтр с ячейками 250 микрон.

Вихревой поток проходит насквозь. И фильтруем через сетчатый фильтр 70 микрон, собирая через себя оставшийся поток. Центрифугируйте суспензию.

Выделение одиночных эпителиальных клеток с помощью градиента Перколла. Вам понадобятся следующие материалы. Профильтровав через бумагу предварительного фильтра AP15, приготовьте 40% и 20% Percoll в воде Milli-Q.

Загрузите стерильный шприц раствором Percoll. Нанесите его на фильтрующую установку и медленно выгрузите Percoll. Охладите до четырех градусов Цельсия в течение часа перед слоистым градиентом.

Настройте перистальтический насос, как показано на рисунке. С помощью перистальтического насоса, установленного на самую низкую скорость, выложите три мл 40% Percoll в ультрацентрифужную пробирку объемом 16 мл. Дайте ему осесть на льду в течение 15 минут.

Скорость насоса должна приводить к расходу менее одного мл в минуту. Наклонив трубку под углом 45 градусов, с помощью перистальтического насоса нанесите 20% Percoll поверх 40%-ного слоя. Убедитесь, что выходная трубка прилегает к центрифужной трубке, чтобы предотвратить смешивание капель с нижними слоями.

Скорость насоса должна приводить к расходу менее одного мл в минуту. Дайте слоям осесть на льду в течение 15 минут. Использование перистальтического насоса со скоростью потока менее одного мл в минуту для слоя три мл раствора DMEM, содержащего выделенные эпителиальные клетки, с градиентом Перколла от 20 до 40%.

Убедитесь, что выходная трубка прилегает к центрифужной трубке, чтобы предотвратить смешивание капель с нижними слоями, нарушающее градиент. Центрифугируйте при 600 г в течение 10 минут. Соберите интерфазы между DMEM, 20%-ным градиентом Перколла и 20%40%-ным градиентом Перколла, чтобы выделить эпителиальные одиночные клетки.

Биотинилирование белков клеточной поверхности и выделение биотинилированных поверхностных белков. Вам понадобятся следующие материалы. Биотинилат 100 микролитров эпителиальных клеток одиночных клеток с использованием набора для конъюгации биотина типа А в соответствии с инструкциями производителя.

Добавьте 100 микролитров PBS, 1% Triton X-100, 10% глицерина, 100 микромоль окисленного глутатиона и PIC к биотинилированным клеткам. Выдерживайте на льду в течение часа, аккуратно перемешивая каждые 10 минут. Центрифугируйте клеточный экстракт при 20 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут и отложите в сторону.

Приготовьте 50 микролитров магнитных шариков стрептавидина, промыв 1 000 микролитров TBS 1%Tween-20. Аккуратно перемешайте, перелистывая пальцем. Поместите трубку в магнитную подставку, собрав бусины у стенки трубки.

Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Соедините 300 микролитров биотинилированных белков клеточной поверхности с промытыми магнитными шариками. Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре с перемешиванием.

Соберите бусины с помощью магнитной подставки, извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в пробирку 300 микролитров TBS 1%Tween-20, аккуратно перемешивая, чтобы снова суспендировать шарики. Соберите бусины, удалите и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторите этот шаг промывки дважды. Добавьте 100 микролитров 1 молярного глицина pH 2 в магнитные шарики. И выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Соберите шарики и удалите надосадочную жидкость, содержащую элюированные биотинилированные поверхностные белки. На первом рисунке представлен протокол, используемый для выделения эпителиальных клеток и их поверхностных белков из целого клеща. Используя этот протокол, приблизительно от 1,2 на 10 до семи клеток на мл с жизнеспособностью от 75 до 80% и от 20 до 24 мкг очищенных биотинилированных поверхностных белков могут быть очищены путем первоначального рассечения 50 клещей.

Репрезентативная флуоресцентная микроскопическая визуализация эпителиальных клеток клещей, полученных с использованием этого протокола, показана на рисунках 2А и 2В. Клетки выглядят как единичные, сферические, с гладкой морфологией поверхности и одинаковым размером по всему образцу. Визуализация плохих изолятов заключается в том, что они содержат неполную диссоциацию отдельных эпителиальных клеток с различными популяциями клеток, идентифицированными по различным размерам и морфологии клеток.

Перекрестное загрязнение белками хозяина, рисунок 3A, может быть сведено к минимуму путем адекватного промывания кишок клеща для получения белого или прозрачного градиента Перколла, рисунок 3B. Сравнение белков с помощью SDS-PAGE, рисунок 4A, серебряное окрашивание, рисунок 4B, точечный блот, рисунок пять, и ELISA, рисунок 6, показывает, что описанные методики успешно очищают биотинилированные поверхностные белки из отдельных эпителиальных клеток, выделенных из кишечника клеща Rhipicephalus microplus. В заключение следует отметить, что методы, использованные в этом исследовании, позволили успешно выделить отдельные эпителиальные клетки из всего кишечника Rhipicephalus microplus.

Для дальнейшего анализа и исследований были получены белки с поверхности эпителиальных клеток Rhipicephalus microplus. Наконец, разработанный протокол продемонстрировал потенциальный выход отдельных эпителиальных клеток из кишечника клеща и эффективность биотинилированных поверхностных белков клетки. Разработанный протокол может быть использован на любых видах клещей, имеющих экономическое значение, в целях изучения взаимодействия клещей и хозяина путем изучения белкового состава мембраны кишечника.